Showing posts with label DATO. Show all posts
Showing posts with label DATO. Show all posts
Jan 21, 2015
sgRNA construction
關於CRISPR sgRNA的設計跟構築
除了委託廠商代工外
現在常用的方法
是利用外切 restriction enzyme去製造linear plasmid
再利用合成stick end 互補股引子的方式去 ligation
常用的restriction enzyme會是類似BbsI這類特別的酵素
因為他們的切點在辨識序列的外側 (5' or 3')來行成stick end
所以只要在合成primer的時後先預留正確的extra base
將回溶/reannealing/PNK 處理過的片段作ligation
就能得到sgRNA vector，
要在經定序後確認，即可得到sgRNA。
目前sgRNA的確認只能用定序的，因為塞入的片段太小(23bp)，
加上sgRNA設計的時候沒有在原始被移除的序列中加上vector其他部位已經有的切位
所以需要這部，或是可以在製造linear vector的時後check 不會有 uncut vector存在
addgene提供的 空sgRNA vector 多數是用這個方法(Humanized sgRNA是例外，我被暗算過)
empty sgRNAhttp://www.addgene.org/crispr/empty-grna-vectors/
裡面也有提供類似冷泉港的單一vector。
利用這個方式建構的sgRNA成本會遠低於委託廠商代工
主要花的錢包含vector購買(NT 3000)/ primer 合成 (~50 bp per clone)/
PNK 跟 restriction enzyme (各約莫三千元左右，可多次使用)
以下在附上我常用的sgRNA設計網站
sgRNA design
http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
最後附上 sgRNA構築的protocol
sgRNA construct
Jul 13, 2014
CellProfiler
Paper:
http://genomebiology.com/content/pdf/gb-2006-7-10-r100.pdf
軟體下載網頁:
http://www.cellprofiler.org/
這也是BROAD Institute 出的一個軟體
應該可以取代AIS 來計算invasion 細胞數目
甚至可以提供更多功能
只是 目前我自己沒有要用到的地方 就沒有鑽研了!
http://genomebiology.com/content/pdf/gb-2006-7-10-r100.pdf
軟體下載網頁:
http://www.cellprofiler.org/
這也是BROAD Institute 出的一個軟體
應該可以取代AIS 來計算invasion 細胞數目
甚至可以提供更多功能
只是 目前我自己沒有要用到的地方 就沒有鑽研了!
Dec 28, 2013
CRISPR/Cas9 Plasmids
https://www.addgene.org/CRISPR/
Addgene最近在賣的一系列有趣的plasmid
(addgene的另外意思就是 不貴)
目的是辨識特定DNA序列，去切斷、造成Nick、抑制基因表現或是促進基因表現。
最早能辨識DNA序列的 是Zinc finger，後來出現TALEN，這兩個都是protein為主的數位編碼。
後來又有人發現CRISPR/Cas系統
CRISPR/Cas9本來是用在抵禦外來DNA，辨識序列、切斷。
整個原理
簡單的說 Cas9會利用guide RNA (特定序列+一個二級結構的RNA)去辨識DNA序列
再將雙股DNA切斷 (去防禦外來DNA入侵)
一開始被利用其實是拿來做transgene ES，增加DNA recombination 的效率。
這幾年陸續有人將enzyme activty移除，甚至做成fusion protein，
接上抑制性domain HP1/KABP)或是活化domain (VP64)，去專一性的抑制或表現特定基因。
跟Zinc finger跟TALEN比起來，其辨識主要是gRNA 序列而不是protein的排列順序(編碼)
所以可以利用合成oligo-nucletides insert 到gRNA expression plasmid去達成鑑別力，
整個彈性、速度跟CP值，完全大勝前兩項。
CRISPR抑制 (CRISPRi)也可以媲美RNAi，甚至更好。
我看其中一篇reference，他們做CRISPRi後去做Sequence，
發現專一性極高，也無off-target effect。(paper data都是最漂亮的! 哈)
然後合成DNA primer的價錢，也遠比RNA 便宜很多，所以CP值跟彈性都更高。
activation部分，也可以去操作特定基因﹐的表現。
可以用來證明某些未知的transcript 是來自於同一個還是獨立的。
其實在Zinc finger/TALEN的部分，
也是有人將epigentic enzyme，DNMT, PRC Complex or Tet去做fusion，
去達成特地區域的epigentic change。
CRISPR應該也可以做到。
以上資訊分享給大家囉。(就當作我journal club的報告吧!!超敷衍!! 哈)
Addgene最近在賣的一系列有趣的plasmid
(addgene的另外意思就是 不貴)
目的是辨識特定DNA序列，去切斷、造成Nick、抑制基因表現或是促進基因表現。
最早能辨識DNA序列的 是Zinc finger，後來出現TALEN，這兩個都是protein為主的數位編碼。
後來又有人發現CRISPR/Cas系統
CRISPR/Cas9本來是用在抵禦外來DNA，辨識序列、切斷。
整個原理
簡單的說 Cas9會利用guide RNA (特定序列+一個二級結構的RNA)去辨識DNA序列
再將雙股DNA切斷 (去防禦外來DNA入侵)
一開始被利用其實是拿來做transgene ES，增加DNA recombination 的效率。
這幾年陸續有人將enzyme activty移除，甚至做成fusion protein，
接上抑制性domain HP1/KABP)或是活化domain (VP64)，去專一性的抑制或表現特定基因。
跟Zinc finger跟TALEN比起來，其辨識主要是gRNA 序列而不是protein的排列順序(編碼)
所以可以利用合成oligo-nucletides insert 到gRNA expression plasmid去達成鑑別力，
整個彈性、速度跟CP值，完全大勝前兩項。
CRISPR抑制 (CRISPRi)也可以媲美RNAi，甚至更好。
我看其中一篇reference，他們做CRISPRi後去做Sequence，
發現專一性極高，也無off-target effect。(paper data都是最漂亮的! 哈)
然後合成DNA primer的價錢，也遠比RNA 便宜很多，所以CP值跟彈性都更高。
activation部分，也可以去操作特定基因﹐的表現。
可以用來證明某些未知的transcript 是來自於同一個還是獨立的。
其實在Zinc finger/TALEN的部分，
也是有人將epigentic enzyme，DNMT, PRC Complex or Tet去做fusion，
去達成特地區域的epigentic change。
CRISPR應該也可以做到。
以上資訊分享給大家囉。(就當作我journal club的報告吧!!超敷衍!! 哈)
May 28, 2013
May 30, 2012
Database of Gene Transcription in Mouse Embryo
Database of Gene transcription in mouse embryo
http://www.eurexpress.org/ee/intro.html
上面的資料庫是利用In situ hybirdization
來偵測特定基因/ microRNA 在老鼠胚胎中的表現強度與位置
可以用來尋找有興趣的基因 在老鼠發育的過程中是否有扮演角色
http://www.eurexpress.org/ee/intro.html
上面的資料庫是利用In situ hybirdization
來偵測特定基因/ microRNA 在老鼠胚胎中的表現強度與位置
可以用來尋找有興趣的基因 在老鼠發育的過程中是否有扮演角色
Subscribe to:
Posts (Atom)