還記得我打開II網站 看看我已經revised1個多月的paper..
突然看到 ACCEPTED...我跳起來 抱住助理 心想我終於可以畢業了..
一把鼻涕 一把眼淚 打給我老媽
午覺正甜的的媽媽 以為我被綁架哩..((她被詐騙集團騙過))...
原本停滯的博班生活 一下子忙碌起來..
所以 於2008年3月14日...我終於口試了..
那天 林以行老師 還開了一瓶 粉紅色的香檳 幫我跟嘉玲慶祝...
接下來一陣子 走路都會傻笑.....
(((因為很開心 我終於唸畢業啦......)))
我回了高雄 過了一陣子陪媽媽買麵包的日子
覺得超級幸福的...
然後 一轉眼 就來到 什麼都挑高的 國衛院啦
這裡是一個很是一個作實驗很優的環境
加上 這個實驗室的老師 同事 學妹啊 人都很好
我好像沒什麼好抱怨的.....
呼呼 我只適應了一下下 就覺得 很喜歡啦...
希望 來年 整個實驗室順利 paper大發....旺旺旺!!!
Dec 31, 2008
小龜祈願文
我在台北，但我絕對離好命很遠很遠，明天能放四天假，已經讓我感恩到想痛哭流涕了。
看起來我寄的卡片有順利地到達，我自己覺得三張卡片一起寄真是非常聰明的決定，感謝素芳老師！
2008年剩下不到十四個小時了，也要來「懷舊」一下......
年初的時候是怎麼想的？我忘的差不多了，但大多是關於實驗的雄心壯志吧，但好多事還是沒有完成，本來的未來預想圖讓一個已伏筆了許久了「想不到」而打亂了，今年最大的感嘆就是：人算不如天算，天算不如不要算。
今 年能平安的渡過，真的該感謝很多人，在竹南的嬿如學姊、玉蓮學姊和超級厲害的素芳老師，謝謝你們願意聽我胡言亂語；在台北的EBV group中的學長姊和學弟妹，感謝你們沒有因為我老是瘋瘋癲癲，就把我踢出去；還有各位寬容又厲害的老師們，託大家的福，讓我領到一張可以出去混吃騙喝 的文憑，感恩到五體投地！三叩首！
明年，我有很多小小心願想要達成，第一個小小心願正在努力中，希望能如願，拜託拜託，各路神佛，請給我多一點點好運......
第二個小小心願是，我希望我能做出我會喜歡的好data。
第三個小小心願是，我要勇敢一點，要更努力一點，要更有效率的過每一天。
第四個小小心願是，不要再有人叫我哈利波特啦！我一點也不像啦！(很認真的說)
第五個小小心願是，希望所有人都平安健康！
看起來我寄的卡片有順利地到達，我自己覺得三張卡片一起寄真是非常聰明的決定，感謝素芳老師！
2008年剩下不到十四個小時了，也要來「懷舊」一下......
年初的時候是怎麼想的？我忘的差不多了，但大多是關於實驗的雄心壯志吧，但好多事還是沒有完成，本來的未來預想圖讓一個已伏筆了許久了「想不到」而打亂了，今年最大的感嘆就是：人算不如天算，天算不如不要算。
今 年能平安的渡過，真的該感謝很多人，在竹南的嬿如學姊、玉蓮學姊和超級厲害的素芳老師，謝謝你們願意聽我胡言亂語；在台北的EBV group中的學長姊和學弟妹，感謝你們沒有因為我老是瘋瘋癲癲，就把我踢出去；還有各位寬容又厲害的老師們，託大家的福，讓我領到一張可以出去混吃騙喝 的文憑，感恩到五體投地！三叩首！
明年，我有很多小小心願想要達成，第一個小小心願正在努力中，希望能如願，拜託拜託，各路神佛，請給我多一點點好運......
第二個小小心願是，我希望我能做出我會喜歡的好data。
第三個小小心願是，我要勇敢一點，要更努力一點，要更有效率的過每一天。
第四個小小心願是，不要再有人叫我哈利波特啦！我一點也不像啦！(很認真的說)
第五個小小心願是，希望所有人都平安健康！
Dec 30, 2008
回顧2008
跟蔡小丸說好一定要寫心得的~ 所以上來乖乖寫~ 嘿嘿
恩~2008年, 我要感謝挺多人的, 雖然我還沒做出個什麼有貢獻的事情出來
可是~ 我要把預計要做的東西 全部做出來~!
醬才有人會叫我 "超˙人" 這是我2009年的新年新希望! 哈哈哈
今年我惡搞了一堆data,
跑了長得像心電圖的Western, 還有突然band歪一邊的gel,
還有一堆不能reproduce的結果
還有謎樣的p21, p27, 我永遠搞不懂他到底是上升還下降
希望2009不要再出現這種東西啦~ 新年新希望part 2
每次跟學長們和SFL講實驗的事情, 都不由得很羨慕
感覺就是真的飽讀詩書ㄟ~
是要怎麼把哪一個lab做出什麼東西,還在哪一年發在什麼journal上都記起來?
希望我以後也能這樣~ 新年新希望part 3
也感謝遠在台北的敏敏小朋友, 還寄卡片給我的小龜小朋友
還感謝各位仁兄 容忍我的沒禮貌阿~
偶而口氣很衝都是無意義的ㄚ~ 不好意思~ 請原諒我
阿門~
希望明年也能聽到很多"恩~很棒!"
祝 大家新年快樂 事事順心^O^~
恩~2008年, 我要感謝挺多人的, 雖然我還沒做出個什麼有貢獻的事情出來
可是~ 我要把預計要做的東西 全部做出來~!
醬才有人會叫我 "超˙人" 這是我2009年的新年新希望! 哈哈哈
今年我惡搞了一堆data,
跑了長得像心電圖的Western, 還有突然band歪一邊的gel,
還有一堆不能reproduce的結果
還有謎樣的p21, p27, 我永遠搞不懂他到底是上升還下降
希望2009不要再出現這種東西啦~ 新年新希望part 2
每次跟學長們和SFL講實驗的事情, 都不由得很羨慕
感覺就是真的飽讀詩書ㄟ~
是要怎麼把哪一個lab做出什麼東西,還在哪一年發在什麼journal上都記起來?
希望我以後也能這樣~ 新年新希望part 3
也感謝遠在台北的敏敏小朋友, 還寄卡片給我的小龜小朋友
還感謝各位仁兄 容忍我的沒禮貌阿~
偶而口氣很衝都是無意義的ㄚ~ 不好意思~ 請原諒我
阿門~
希望明年也能聽到很多"恩~很棒!"
祝 大家新年快樂 事事順心^O^~
Dec 24, 2008
暑期生推甄情形
真是恭喜她們!
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老師妳好:
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老師妳好:
我是淑華，告訴你三件好消息，我們三個都考上了研究所，
----------------------------------------------------------------10/23/2003 SFL wrote:
暑假來的三位暑期生報考研究所情形:陳彥君(中正資訊工程,中原生物醫學工程,中央系統生物與生物資訊,元智生物與醫學資訊)、吳淑華(中興資訊科學與工程,東海資訊工程與科學,逢甲生物資訊暨生醫工程)、陳佳足(長庚資訊工程,屏東科動物疫苗科技研究所),報給各位學長姐知道一下!他們是認真的耶,我們怎可懈怠!
補充:
亞洲大學 楊宗泰老師曾在本院資訊組任職過
Dec 15, 2008
Dec 4, 2008
什麼是元旦連假?
誰能告知一下今年元旦假期怎麼放?我想挑一天實驗室大掃除/望年會/分享/進度報告…然而我桌面上待寫的有年終報告/新年度計畫/國科會計畫/癌研所考評報告… 到底什麼是元旦連假?怎麼放?如果我們把和美||元老師家的聯合望年會改成一月份好嗎?院內的是1/14星期三,而除夕是1/25星期日。還有,妙極了,第一次看到CO2間紅燈會亮!是349的功勞嗎?謝謝Ingrid(下次能在網誌上公佈一下更好)。
在sflin3 blogspot上貼文與灌水,是你我的責任與樂趣—放手寫吧、大聲說吧。
在sflin3 blogspot上貼文與灌水,是你我的責任與樂趣—放手寫吧、大聲說吧。
Nov 16, 2008
細胞老化論文被接受了 大家來吃糖喲
要感謝許多人:彭汪院士的接納,PWW與Ingrid的不棄不離,小蓮與小嬿的信任以及堅持到底的耐力,小丸子的情義相挺沒有接受另一個高就機會(一定要讓你有類似機會時可展翅而飛!),小龜的細心用功與謙遜,以及Mikhail Blagosklonny一系列在Cell Cycle上的好文采!心情有一點激動,母上大人比我還興奮,塞了包下午搶購到的法國松露巧克力,要我明早帶去和大家分享(小龜我會想辦法找人送到實驗室給你的). 嗚嗚嗚好感動啊...(ps.昨天的婚禮也很棒,那一盒素餅已被一個大人和二個小孩(合計76歲)吃掉一半以上了.還一直問我,新娘肯定很漂亮,餅才會這麼好吃... 謝謝and再次恭喜PWW!)
Nov 5, 2008
新的實驗(11/7~11/13)和老闆交辦事項(有更新)
做每一步驟前請先問自己:有放輕鬆嗎?清楚現在在做什麼吧。做完後紙頭、小抄記得收集好放入本院高級的實驗記錄本中。再滿意、微笑地清理現場,然後鎮靜地離開…
FOR AB730-first set(三重複|丸英蓮)
星期四(11/6):每位主刀者請挑Luc48算一下一格well的細胞數,謝謝。待抽RNA/protein的細胞均勻打散後置入-80冰箱中(每人有20管—微微震撼ORZ)。
FOR AB730-second set(二重複|丸英)
星期五(11/7):各細胞maintain者種三個含2.5~3M細胞的十公分盤。
星期一(11/10):丸英請seed 6孔盤,記得培養在不含藥的tet-free medium中(0.5M/well,Luc那一組0.3M/well)。主要是因為RNeasy只能容許10M/column.
星期二(11/11):丸英六孔盤每個well都加dox。小蓮請收取11/7 seed 的十公分盤細胞,要算細胞數。請以6~10M為一管,每種收兩管,均勻打散後置入-80冰箱中。這是我們零點的對照組,未雨稠繆用的啦。
星期三(11/12):丸英取一盤6孔盤做wash-off步驟。今天來抽第一批的蛋白質—請小蓮、小嬿主刀,丸英協助(共有30管,二度震撼ORZ)。
星期四(11/13):收細胞,五格for RNA,一格for protein(每人有20管,三度震撼ORZ)。
重點整理
星期五(11/7):種十公分盤細胞三盤、下午上環安課。
星期一(11/10):種六孔盤細胞、下午聽所內演講。
星期二(11/11):六孔盤加dox、收零點的對照組、下午大瞇(丸嬿自由發揮、英蓮拍手)。
星期三(11/12):六孔盤做wash-off步驟、抽第一批的蛋白質。
星期四(11/13):收細胞,5-well for RNA,1-well for protein。Bio-Rad要來demo ChemoDoc儀器。ただいま!若ready請開始跑5~6片小膠:三組Luc/6個sample跑一片來比較。同理,三組ER跑一片,那片若能偵測p27更棒。三組KR跑一片,三組EV跑一片來測EAD,三組KR跑一片來測KbZIP。
個別叮嚀
小蓮:(1)發票抬頭是維護費或維修費均可。(2)HONE-1該補的圖包括flag-egfp, flag-er, p21, p27, rH2AX, actin若已okay,放假前請記得上傳至nas,謝謝。(3)對了那一份PI3K LYxxx/Rapa versus ER-senescence實驗的結果,可不可以也掃描上傳一下。應該就是這兩樣問題會問吧,怎麼還沒消息呢?好慢。
大家懷念AMO cake嗎?下週回來時會帶一份過來給比較勤奮的人品嚐。
FOR AB730-first set(三重複|丸英蓮)
星期四(11/6):每位主刀者請挑Luc48算一下一格well的細胞數,謝謝。待抽RNA/protein的細胞均勻打散後置入-80冰箱中(每人有20管—微微震撼ORZ)。
FOR AB730-second set(二重複|丸英)
星期五(11/7):各細胞maintain者種三個含2.5~3M細胞的十公分盤。
星期一(11/10):丸英請seed 6孔盤,記得培養在不含藥的tet-free medium中(0.5M/well,Luc那一組0.3M/well)。主要是因為RNeasy只能容許10M/column.
星期二(11/11):丸英六孔盤每個well都加dox。小蓮請收取11/7 seed 的十公分盤細胞,要算細胞數。請以6~10M為一管,每種收兩管,均勻打散後置入-80冰箱中。這是我們零點的對照組,未雨稠繆用的啦。
星期三(11/12):丸英取一盤6孔盤做wash-off步驟。今天來抽第一批的蛋白質—請小蓮、小嬿主刀,丸英協助(共有30管,二度震撼ORZ)。
星期四(11/13):收細胞,五格for RNA,一格for protein(每人有20管,三度震撼ORZ)。
重點整理
星期五(11/7):種十公分盤細胞三盤、下午上環安課。
星期一(11/10):種六孔盤細胞、下午聽所內演講。
星期二(11/11):六孔盤加dox、收零點的對照組、下午大瞇(丸嬿自由發揮、英蓮拍手)。
星期三(11/12):六孔盤做wash-off步驟、抽第一批的蛋白質。
星期四(11/13):收細胞,5-well for RNA,1-well for protein。Bio-Rad要來demo ChemoDoc儀器。ただいま!若ready請開始跑5~6片小膠:三組Luc/6個sample跑一片來比較。同理,三組ER跑一片,那片若能偵測p27更棒。三組KR跑一片,三組EV跑一片來測EAD,三組KR跑一片來測KbZIP。
個別叮嚀
小蓮:(1)發票抬頭是維護費或維修費均可。(2)HONE-1該補的圖包括flag-egfp, flag-er, p21, p27, rH2AX, actin若已okay,放假前請記得上傳至nas,謝謝。(3)對了那一份PI3K LYxxx/Rapa versus ER-senescence實驗的結果,可不可以也掃描上傳一下。應該就是這兩樣問題會問吧,怎麼還沒消息呢?好慢。
大家懷念AMO cake嗎?下週回來時會帶一份過來給比較勤奮的人品嚐。
Microplate Vortex
有一個好理由說明不要用它來做trafsfection mixer:this machine serves up-down "micro" mixing. Yet, after well-vortex, it suggests you to do a centrifugation step, to bring down everything back to the bottom. Without this step, some HD/DNA mix may adhere on the wall of microplate.所以,辛苦一點,在eppendorff內做調配DNA/HD的動作吧!謹勉之。
Nov 4, 2008
環安檢查 (更新)
請大家參加11/7(星期五下午一點半到四點半)的通識教育。講義請ingrid準備。另外,我們實驗室日後化安負責人是ingrid(小嬿協助)、生安負責人是小蓮(Maruko協助)。細節部份及要填寫的資料與表格會再和各負責人討論。先謝謝大家,預祝我們早日成為一個安全舒適又不麻煩(找人或被找)的實驗室!
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10/23/2008 SFL wrote:
已安全過關,謝謝大家配合演出。改進事項: (餘略)
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10/23/2008 SFL wrote:
已安全過關,謝謝大家配合演出。改進事項: (餘略)
Nov 1, 2008
soldier心得
各位, 我放假了...呵呵 ^^
跟大家報告一下soldier心得吧 ~
我的兵役配置時間大約是 "成功嶺2個月" "林口衛校2.5個月" "下部隊4.5個月"三個階段
目前仍在第一階段成功嶺過程...
至於操不操呢? 反正就是跑跑步, 伏地挺身, 仰臥起坐, 拉單槓, 丟手榴彈等
達不到標準好像也不會怎樣 (我是都有過啦, 壁球社可不是混假的 ^^)
阿我們都是一票老兵啦, 要求似乎不太高 (幾乎都是碩博士阿, 班長都比我們小好幾歲)
so 這兩個星期幾乎都在打混, 填資料, 適應環境...等
反正軍人真的有的就是時間, 三四個表格可以填上1個星期 (昏)
15分鐘可以上完的課, 教了1整天 (ex.拆槍的步驟)...
4, 5首軍歌可以唱上3, 4天 (沒譜, 結果每個班長都教不一樣版本 Orz)
下星期我應該會帶書跟iPOD進去了...不然會悶到爆...XD
目前比較不適應就是伙食吧, 按...難吃到爆...青菜水果少的可憐
然後青菜沒一餐是綠的...(阿...開始懷念院餐了, 好吃100倍有吧)
再者失去自由的感覺真的很不舒服, 尤其我這種自由慣的人...很不爽 XD
還好之後我就開始週休二日了 , 勉強可以平衡一下 ...哈哈
先降吧...
ps1. Lab還ok吧 ? 我有沒有沒交接好的地方? 需不需要再回去處理一下?
ps2. 要跟仲峻說sorry一下, 宿舍搬的太匆忙, 來不及幫你掃乾淨啦 >.<
ps3. 玉蓮, 沒喝咖啡真的會很想睡覺... 我現在超痛苦阿 ~~~
跟大家報告一下soldier心得吧 ~
我的兵役配置時間大約是 "成功嶺2個月" "林口衛校2.5個月" "下部隊4.5個月"三個階段
目前仍在第一階段成功嶺過程...
至於操不操呢? 反正就是跑跑步, 伏地挺身, 仰臥起坐, 拉單槓, 丟手榴彈等
達不到標準好像也不會怎樣 (我是都有過啦, 壁球社可不是混假的 ^^)
阿我們都是一票老兵啦, 要求似乎不太高 (幾乎都是碩博士阿, 班長都比我們小好幾歲)
so 這兩個星期幾乎都在打混, 填資料, 適應環境...等
反正軍人真的有的就是時間, 三四個表格可以填上1個星期 (昏)
15分鐘可以上完的課, 教了1整天 (ex.拆槍的步驟)...
4, 5首軍歌可以唱上3, 4天 (沒譜, 結果每個班長都教不一樣版本 Orz)
下星期我應該會帶書跟iPOD進去了...不然會悶到爆...XD
目前比較不適應就是伙食吧, 按...難吃到爆...青菜水果少的可憐
然後青菜沒一餐是綠的...(阿...開始懷念院餐了, 好吃100倍有吧)
再者失去自由的感覺真的很不舒服, 尤其我這種自由慣的人...很不爽 XD
還好之後我就開始週休二日了 , 勉強可以平衡一下 ...哈哈
先降吧...
ps1. Lab還ok吧 ? 我有沒有沒交接好的地方? 需不需要再回去處理一下?
ps2. 要跟仲峻說sorry一下, 宿舍搬的太匆忙, 來不及幫你掃乾淨啦 >.<
ps3. 玉蓮, 沒喝咖啡真的會很想睡覺... 我現在超痛苦阿 ~~~
Oct 30, 2008
Hoeffer SE260盤點整理(小蓮最終版)
新添購一組SE260當中包含：5組玻璃(透明玻璃10片，白色鋁片5片)，0.75-mm的spacer和10-well comb各兩組。
目前整理如下:
3組Hoeffer SE260電泳槽裝置
(包括做膠的caster，其中一個螃蟹夾轉鈕壞了)
Spacer
1.5-mm：8 (支)
1.0-mm：8
0.75-mm：12
10-well Comb
1.5-mm：4 (個)
1.0-mm：4
0.75-mm：6
15-well Comb
1.0-mm：4
1.5-mm：2
玻璃
外面流通使用~
白色鋁片：9片
玻璃：11片
未開封~
4盒20片全新透明玻璃
(其中一盒含5片白色鋁片)
與MSC lab借:
兩套做膠的caster
3對紅色夾子
目前整理如下:
3組Hoeffer SE260電泳槽裝置
(包括做膠的caster，其中一個螃蟹夾轉鈕壞了)
Spacer
1.5-mm：8 (支)
1.0-mm：8
0.75-mm：12
10-well Comb
1.5-mm：4 (個)
1.0-mm：4
0.75-mm：6
15-well Comb
1.0-mm：4
1.5-mm：2
玻璃
外面流通使用~
白色鋁片：9片
玻璃：11片
未開封~
4盒20片全新透明玻璃
(其中一盒含5片白色鋁片)
與MSC lab借:
兩套做膠的caster
3對紅色夾子
Oct 29, 2008
Oct 24, 2008
Oct 23, 2008
新的實驗(10/30~11/6)
Sample ID (182240):
A(Luc48)B(Luc24off24）Luc小丸子
C(ER48) D(ER24off24) ER小蓮 (p11)
E(KR48) F(KR24off24) KR小丸子(p4)G(EV48) H(EV24off2) EV小嬿I(KV48) J(KV24off24) KV小蓮 (p8)
各細胞maintain者在星期五種三個10公分盤(2.5~3M),
隔週週一,每種細胞seed兩個6孔盤(0.5M/well)培養在不含藥的tet-free medium中。
週二全部加dox。
週三取一盤6孔盤做wash-off步驟。
週四收細胞(五格for RNA,一格for protein)。
小丸子負責三個重複中的第一組,Ingrid負責三個重複中的第二組,小蓮負責三個重複中的第三組。
哪一組細胞送抽RNA做microarray呢?把30個protein sample先抽好做flag,p21,KbZIP, EA-D等測試,看induction及wash-off情形再定。因為要抽RNA,所以所有細胞harvest下來後均勻拍散,全部先放進-80C冰箱待用。5M細胞約可抽出50ug RNA,而我們的需要量是3~5ug左右。
--------------------------------------------------------------------------------------------
2008/10/16 SFL wrote:
Purpose: To analyze transcriptome changes modulated by R. (餘略)
A(Luc48)B(Luc24off24）Luc小丸子
C(ER48) D(ER24off24) ER小蓮 (p11)
E(KR48) F(KR24off24) KR小丸子(p4)G(EV48) H(EV24off2) EV小嬿I(KV48) J(KV24off24) KV小蓮 (p8)
各細胞maintain者在星期五種三個10公分盤(2.5~3M),
隔週週一,每種細胞seed兩個6孔盤(0.5M/well)培養在不含藥的tet-free medium中。
週二全部加dox。
週三取一盤6孔盤做wash-off步驟。
週四收細胞(五格for RNA,一格for protein)。
小丸子負責三個重複中的第一組,Ingrid負責三個重複中的第二組,小蓮負責三個重複中的第三組。
哪一組細胞送抽RNA做microarray呢?把30個protein sample先抽好做flag,p21,KbZIP, EA-D等測試,看induction及wash-off情形再定。因為要抽RNA,所以所有細胞harvest下來後均勻拍散,全部先放進-80C冰箱待用。5M細胞約可抽出50ug RNA,而我們的需要量是3~5ug左右。
--------------------------------------------------------------------------------------------
2008/10/16 SFL wrote:
Purpose: To analyze transcriptome changes modulated by R. (餘略)
Oct 21, 2008
For CCL Lab Meeting Papers
Oct 17, 2008
祝福逸人當官順利
有空要多留言喔,告訴我們你很威風(或是相反)。分發時抽到能幫助你成長的籤。吃到不好吃的食物就立刻回想起在這裡的種種negative controls。志玲姐姐改走勞軍路線、胃疼不藥而癒、前途光明燦爛!
Oct 13, 2008
深思熟慮的Pol II (10/13 更新)
RNA Polymerase II Pausing 的延伸閱讀
歷史背景介紹(before 2005):1986年Lis實驗室首先發現以chromatin immunoprecipitation (ChIP)偵測RNA Pol II在果蠅Hsp70 promoter(hsp70)的結合位點時,發現雖然還未被heat induction,但hsp70上卻已有Pol II binding.他們進一步以KMnO4 footprinting和nucear-run等解析度較高的技術算出,在未被heat shock的hsp70上 面Pol II結合位點集中在transcription start site下游20~50 nt附近(+20~50).這種RNA Pol II停在+1下游40 nt左右,而且不再往前polymerization的狀態稱為promoter-proximal pausing.因為hsp70被heat shock後transcript的合成的上昇速率高達100~1000倍之多,因此當初認為這應該僅僅是少數的特例之一.在mammalian cell中較為熟知的類似例子有三,分別是c-myc (1992), c-fos(2006), 和junB(2006). Pausing 的另一種含義是elongation受阻,在in vitro實 驗中發現,若加入positive transcription elongation factor b (P-TEFb)那pausing的現象可被大幅解除.P-TEFb是由cyclinT1和CDK9組成.其中CDK9扮演的角色就是 phosphorylate停滯在promoter-proximal pausing上的三種成份:(1)Pol II CTD上的Ser5 (不知道是不是52個repeat上的S5都會被modify) (2)negative elongation factor-DSIF(磷酸化後的DSIF反而變成positive ELF,會與Pol II緊密結合在一起,直到做完transcription後,一起跳海) (3)另一個negative ELF complex叫NELF(由A,B,C/D,E四個subunit組成,磷酸化後的NELF會掉下來,是一個正港的negative elongation factor!) 病毒界有兩個蛋白質是透過與CDK9結合/增加Pol II的elongation及processivity,以彰顯它們transactivation的能力,那就是Tat (HIV) and VP16(HSV).
(正文)2001~2005 年間,tiling-chip在小型genome上成為可行/負擔得起的技術,針對每個基因哪裡到哪裡是它的promoter, transcription start site, splicing site,termination site等等資訊息都很清楚.另外在這段時間內各個物種的transcriptome也已被分析得相當完整.而有關RNA Pol II pausing 的相關研究,首推Bing Ren實驗室發現人類fibroblast genome上,約有5%(~650)的基因具有transcription machinery結合,但卻沒有transcript產生(2005)。 Richard Young實驗室接著發現人類胚胎幹細胞中(embryonic stem cell),也是有許多基因具有Pol II,acetylated H3,H3K4me3等活化marker,但也都沒有transcript被生成,或是具polymerase elongation特有的記號H3K36me3(Jul-2007)。 另外,結合ChIP及tiling chip技術,同一個實驗室在果蠅胚胎突變種Toll10b的genome中發現原來這些不表現mRNA但卻有Pol II結合的基因(~12%,1,614 of 13,448),Pol II大部份被發現停留在+40左右,也就是典型的promoter-proximal pausing狀態(Dec-2007,小嬿seminar paper)。Side-by-side發表的另一篇文章是採用果蠅胚胎細胞株S2為研究材料,這次他們發現約有8%基因有promoter-proximal pausing(Dec-2007)。 綜合對果蠅胚胎發育各階段各基因扮演的角色,和它們expression kinetics的瞭解,這幾個實驗室提出了二個Pol II pausing可能的生物功能(一) active transcriptional repression (二) preparation for rapid activation at later stage of embryongenesis or environmental stimulation.第二種可能性已被今年發表的二篇論文驗證.第一篇發現一半以上有NELF binding 的pomoter其實是屬於可被induction 為high-expression level的基因群(May-2008). 另一篇論文將NELF-B及NELF-E以siRNA方法knock-down後,發現許多基因的表現不升反降,暗示著NELF這群negative elongation factor可能是透過停滯在promoter-proximal site附近,以保持該區chromatin structure處於可隨時被P-TEFb等分子turn-on的狀態.所以許多stress responding gene均可見及Pol II pausing(July-2008).最後這一篇則歸納出promtoer上常見的pausing button(June-2008).
(臆測點1)剛開始吸引我注意的是,NELF-B(Entrez叫它COBRA1)C-端有一段SPSP區域和KRTA的S634~652間非常相像.這種序列是典型會被CDKs磷酸化的位點.雖然Maruko和我不約而同以類似的program猜想五號CDK是最有可能的KR kinase,但現在我想改投九號一票.因為(1)NELF會被P-TEFb(cyclinT1+CDK9)磷酸化而離開pusing site,讓Pol II 往前走; (2)前面提到的Tat和VP16均仰賴CDK9而彰顯其活性; (3)KSHV有一個latent時期表現的gene叫cyclinK ,也被發現和CDK9結合而磷酸化p53上的Ser33.
(臆測點2)為什麼所有的gamma-herpesvirus都用RTA來做latent-lytic switch呢?為什麼RTA/TA domain那麼potent(幾乎贏過所有已測試過的cellular transcription factor的TA domain)?為什麼把RTA家族的a.a. sequence line-up後,大家最相似的部份是在N端DNA-binding domain而非C端的TA domain(可是彼此之間又不能互相swap,互相reactivattion?像ER只認DN-Luc,p21-Luc,而KR只認PAN-Luc, ORF57-Luc)?最棘手的是ER的RRE和KR的RRE都非常degenerate。就算是透過其它結合蛋白來和DNA做contact,二者所依靠的結合蛋白也應該是非常不同。如果把RTAs想像成chromosomal remodeling這一類的蛋白,那它們調節viral gene表現的機制是不是較容易解釋。像小龜加入doxHEp-2TetER後,不到1小時p21表現量就激增;小蓮的細胞老化實驗也顯示,某些基因是同 時被活化、而某一些又是同時被抑制。還有觀察ERKV、EREV8被dox活化,其中一些IE/early蛋白的expression kinetics也是那種一炮衝天的情形,好像前頭有什麼瓶頸似的,現在終於衝破了。那個瓶頸是什麼呢?會是像hsp70被Pol II pausing的狀況嗎?(shouldn't be Flag-ER, cause its expression peaks at 6 hpi, and maintains a stable rate thereafter)
(臆測點3)那麼來看看兩個immediate-early promoter,EBV BRLF1, BZLF1及KSHV RTA, KbZIP(我仿照前頭的寫法,蛋白名稱斜體就是表示該蛋白的promoter)。發現ZEBRA的Jill Countryman最近有一篇J.Virol,非常詳盡地描述BRLF1,BZLF1在接受到這類chemical刺激時,上面histones acetylation的變化情形(Jill是我的美籍學姐,老公是律師,家境優沃,做science是她的興趣,中午一杯yourgot搞定。曾被她唸過一邊聽人演講一邊看自己手上的paper是非常沒有禮貌的行為,從此改掉這個壞習慣)。HH514-16(clone 16)是P3HR1衍生細胞株,可被NaB提引出lytic cycle,但TPA則無效。她發現以三種不同的HDACi (NaB, TSA, VPA)處理clone 16時,BRLF1上的H3,H4均會被acetylated。也就是說Rta的promoter region可被這三種HDACi解開。但奇怪的是,只有NaB和TSA可induce lytic cycle,VPA則不行。好,下一步她反過來用B95-8/Raji這組細胞來做。B95-8/Raji可被TPA或5-Aza-C induce lytic replication,但是HDACi則無效。有趣的是,雖然TPA treated的B95-8有在做lytic replication,可是它的BRLF1/BZLF H3/H4部份卻不見被acetylation。綜合上述兩種結果,BRLF1/BZLF的acetylation與否似乎和走不走lytic cycle無關。那麼,和RNA Pol II pausing有關嗎?(今天有新鮮貝果在後面冰箱,只有讀到這裡的人才知道)。
歷史背景介紹(before 2005):1986年Lis實驗室首先發現以chromatin immunoprecipitation (ChIP)偵測RNA Pol II在果蠅Hsp70 promoter(hsp70)的結合位點時,發現雖然還未被heat induction,但hsp70上卻已有Pol II binding.他們進一步以KMnO4 footprinting和nucear-run等解析度較高的技術算出,在未被heat shock的hsp70上 面Pol II結合位點集中在transcription start site下游20~50 nt附近(+20~50).這種RNA Pol II停在+1下游40 nt左右,而且不再往前polymerization的狀態稱為promoter-proximal pausing.因為hsp70被heat shock後transcript的合成的上昇速率高達100~1000倍之多,因此當初認為這應該僅僅是少數的特例之一.在mammalian cell中較為熟知的類似例子有三,分別是c-myc (1992), c-fos(2006), 和junB(2006). Pausing 的另一種含義是elongation受阻,在in vitro實 驗中發現,若加入positive transcription elongation factor b (P-TEFb)那pausing的現象可被大幅解除.P-TEFb是由cyclinT1和CDK9組成.其中CDK9扮演的角色就是 phosphorylate停滯在promoter-proximal pausing上的三種成份:(1)Pol II CTD上的Ser5 (不知道是不是52個repeat上的S5都會被modify) (2)negative elongation factor-DSIF(磷酸化後的DSIF反而變成positive ELF,會與Pol II緊密結合在一起,直到做完transcription後,一起跳海) (3)另一個negative ELF complex叫NELF(由A,B,C/D,E四個subunit組成,磷酸化後的NELF會掉下來,是一個正港的negative elongation factor!) 病毒界有兩個蛋白質是透過與CDK9結合/增加Pol II的elongation及processivity,以彰顯它們transactivation的能力,那就是Tat (HIV) and VP16(HSV).
(正文)2001~2005 年間,tiling-chip在小型genome上成為可行/負擔得起的技術,針對每個基因哪裡到哪裡是它的promoter, transcription start site, splicing site,termination site等等資訊息都很清楚.另外在這段時間內各個物種的transcriptome也已被分析得相當完整.而有關RNA Pol II pausing 的相關研究,首推Bing Ren實驗室發現人類fibroblast genome上,約有5%(~650)的基因具有transcription machinery結合,但卻沒有transcript產生(2005)。 Richard Young實驗室接著發現人類胚胎幹細胞中(embryonic stem cell),也是有許多基因具有Pol II,acetylated H3,H3K4me3等活化marker,但也都沒有transcript被生成,或是具polymerase elongation特有的記號H3K36me3(Jul-2007)。 另外,結合ChIP及tiling chip技術,同一個實驗室在果蠅胚胎突變種Toll10b的genome中發現原來這些不表現mRNA但卻有Pol II結合的基因(~12%,1,614 of 13,448),Pol II大部份被發現停留在+40左右,也就是典型的promoter-proximal pausing狀態(Dec-2007,小嬿seminar paper)。Side-by-side發表的另一篇文章是採用果蠅胚胎細胞株S2為研究材料,這次他們發現約有8%基因有promoter-proximal pausing(Dec-2007)。 綜合對果蠅胚胎發育各階段各基因扮演的角色,和它們expression kinetics的瞭解,這幾個實驗室提出了二個Pol II pausing可能的生物功能(一) active transcriptional repression (二) preparation for rapid activation at later stage of embryongenesis or environmental stimulation.第二種可能性已被今年發表的二篇論文驗證.第一篇發現一半以上有NELF binding 的pomoter其實是屬於可被induction 為high-expression level的基因群(May-2008). 另一篇論文將NELF-B及NELF-E以siRNA方法knock-down後,發現許多基因的表現不升反降,暗示著NELF這群negative elongation factor可能是透過停滯在promoter-proximal site附近,以保持該區chromatin structure處於可隨時被P-TEFb等分子turn-on的狀態.所以許多stress responding gene均可見及Pol II pausing(July-2008).最後這一篇則歸納出promtoer上常見的pausing button(June-2008).
(臆測點1)剛開始吸引我注意的是,NELF-B(Entrez叫它COBRA1)C-端有一段SPSP區域和KRTA的S634~652間非常相像.這種序列是典型會被CDKs磷酸化的位點.雖然Maruko和我不約而同以類似的program猜想五號CDK是最有可能的KR kinase,但現在我想改投九號一票.因為(1)NELF會被P-TEFb(cyclinT1+CDK9)磷酸化而離開pusing site,讓Pol II 往前走; (2)前面提到的Tat和VP16均仰賴CDK9而彰顯其活性; (3)KSHV有一個latent時期表現的gene叫cyclinK ,也被發現和CDK9結合而磷酸化p53上的Ser33.
(臆測點2)為什麼所有的gamma-herpesvirus都用RTA來做latent-lytic switch呢?為什麼RTA/TA domain那麼potent(幾乎贏過所有已測試過的cellular transcription factor的TA domain)?為什麼把RTA家族的a.a. sequence line-up後,大家最相似的部份是在N端DNA-binding domain而非C端的TA domain(可是彼此之間又不能互相swap,互相reactivattion?像ER只認DN-Luc,p21-Luc,而KR只認PAN-Luc, ORF57-Luc)?最棘手的是ER的RRE和KR的RRE都非常degenerate。就算是透過其它結合蛋白來和DNA做contact,二者所依靠的結合蛋白也應該是非常不同。如果把RTAs想像成chromosomal remodeling這一類的蛋白,那它們調節viral gene表現的機制是不是較容易解釋。像小龜加入doxHEp-2TetER後,不到1小時p21表現量就激增;小蓮的細胞老化實驗也顯示,某些基因是同 時被活化、而某一些又是同時被抑制。還有觀察ERKV、EREV8被dox活化,其中一些IE/early蛋白的expression kinetics也是那種一炮衝天的情形,好像前頭有什麼瓶頸似的,現在終於衝破了。那個瓶頸是什麼呢?會是像hsp70被Pol II pausing的狀況嗎?(shouldn't be Flag-ER, cause its expression peaks at 6 hpi, and maintains a stable rate thereafter)
(臆測點3)那麼來看看兩個immediate-early promoter,EBV BRLF1, BZLF1及KSHV RTA, KbZIP(我仿照前頭的寫法,蛋白名稱斜體就是表示該蛋白的promoter)。發現ZEBRA的Jill Countryman最近有一篇J.Virol,非常詳盡地描述BRLF1,BZLF1在接受到這類chemical刺激時,上面histones acetylation的變化情形(Jill是我的美籍學姐,老公是律師,家境優沃,做science是她的興趣,中午一杯yourgot搞定。曾被她唸過一邊聽人演講一邊看自己手上的paper是非常沒有禮貌的行為,從此改掉這個壞習慣)。HH514-16(clone 16)是P3HR1衍生細胞株,可被NaB提引出lytic cycle,但TPA則無效。她發現以三種不同的HDACi (NaB, TSA, VPA)處理clone 16時,BRLF1上的H3,H4均會被acetylated。也就是說Rta的promoter region可被這三種HDACi解開。但奇怪的是,只有NaB和TSA可induce lytic cycle,VPA則不行。好,下一步她反過來用B95-8/Raji這組細胞來做。B95-8/Raji可被TPA或5-Aza-C induce lytic replication,但是HDACi則無效。有趣的是,雖然TPA treated的B95-8有在做lytic replication,可是它的BRLF1/BZLF H3/H4部份卻不見被acetylation。綜合上述兩種結果,BRLF1/BZLF的acetylation與否似乎和走不走lytic cycle無關。那麼,和RNA Pol II pausing有關嗎?(今天有新鮮貝果在後面冰箱,只有讀到這裡的人才知道)。
Oct 10, 2008
Primary infection of EBV in keratinocytes - the history
2006/10
Molecular and cytogenetic changes involved in the immortalization of nasopharyngeal epithelial cells by telomerase (the link to NCBI)
2008/10/10
這一篇.所以送EBV進入NP460h-hTERT不就等同於把EBV關禁閉?
Dr.George Miller有篇在J.Virol.Methods(2006)的文章,看起來像是一位MD/PhD的學生做的。他以兩位IM病人血清(富含各種anti-EBV抗體)去分離經NaB處理過的P3HR1(HH514)細胞。分什麼呢?分那些在走lytic cycle和不被NaB活化的HH514。分下來後的細胞再送回去petri-dish養。結果發現走lytic cycle的細胞無一存活、而沒有induce的細胞可以再被養回來,而且induction rate隨著時間增加而增加。很有意思的一篇文章。George大學是學歷史的,非常會寫文章,邏輯性很強而且要言不贅,讀他的paper總覺得能做science真好。
Dr.George Miller有篇在J.Virol.Methods(2006)的文章,看起來像是一位MD/PhD的學生做的。他以兩位IM病人血清(富含各種anti-EBV抗體)去分離經NaB處理過的P3HR1(HH514)細胞。分什麼呢?分那些在走lytic cycle和不被NaB活化的HH514。分下來後的細胞再送回去petri-dish養。結果發現走lytic cycle的細胞無一存活、而沒有induce的細胞可以再被養回來,而且induction rate隨著時間增加而增加。很有意思的一篇文章。George大學是學歷史的,非常會寫文章,邏輯性很強而且要言不贅,讀他的paper總覺得能做science真好。
2010/02
MTA_Signed_LinSF_NP460hTERT
2010/08
Epstein-Barr virus infection in immortalized nasopharyngeal epithelial cells: regulation of infection and phenotypic characterization (the link to NCBI)
2012/06
AC944 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial I)
AC957 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial II)
AE003 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial III)
2012/07
AE005 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial IV)
AE011 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial V)
AE015 TW01-ERGV (p3) from Dr. 張堯 YCK 7/28/12
AE016 IFA assay of Dox-treated TW01ERGV-62
hTERT抑制EBV複製及For Phil文章一篇
2008/10/10_hTERT抑制EBV複製及For Phil文章一篇
由 sufang 在 五, 10/10/2008 - 16:40 發表 Older Posts EBV NP460hTERT
Oct 9, 2008
2008 Nobel Prize in Chemistry
Oct 6, 2008
2008 Nobel medicine prize
Oct 3, 2008
又到週末了
那麼,祈願美國經濟不可崩盤,歐盟諸公繼續挺台灣入衛,台灣八點檔連續劇恢復一個鐘頭,青菜水果價格恢復...（喂喂喂,大家多多開文啊,這裡是"Our Thoughts"~寫了不愛還可以自己消掉啊.也許大家都忙著做實驗吧,看來當老闆還是不錯的)下週二Lab meeting時,小嬿要報告RNA Pol II pausing的paper(rehearsal).現在請各位捫心自問:R/Z這些傢伙是怎樣幫忙RNA Pol II做病毒基因轉錄的?
Oct 1, 2008
訊息佈達(更新版/最終話)
On Sep-16-2008 AM 10:00, SFL wrote:
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
-----------------------------------------------------------------------------
三個成見(二不一會):
1. Rta's function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.
Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.
要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.
再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些"cue"所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2)可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以"盤子滿了,得passage!"的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的"功德".這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK...或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:
Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.
(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21's interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的留下一點痕跡吧!
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
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三個成見(二不一會):
1. Rta's function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.
Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.
要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.
再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些"cue"所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2)可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以"盤子滿了,得passage!"的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的"功德".這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK...或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:
Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.
(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21's interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的留下一點痕跡吧!
Sep 26, 2008
Rta和MN
First of all, I want to clarify several disputing issues:
1. Is Rta functional in the cytoplasm? Maybe, but most of the time Rta is working hard in the nucleus.表現量過多,過快,或是一邊進核一邊在胞質內"到此一遊留點紀念"的功能不是今天討論範圍.同理RtaNLSm在我心目中是一個細胞質蛋白,它的主要活性與核內的Rta應是截然不同的.
2. Does over-expression of Rta lead to MN formation in EBV-ve cells?是的,在楚穎論文裡,所算的p值都是許多次實驗重複驗證而成.據聞旻潔加做的synchronize細胞也可觀察到許多multinucleated, binucleated, and mis-segregated cells.
3. Does Rta-mediated MN formation contribute to NPC tumorigenesis?傾向不是.因為在有病毒genome存在下,Rta和其所活化的病毒蛋白會造成細胞停止生長或是凋亡.也就是說 cell cycle還走不到anaphase可能就死了(這個議題應在等我們有充份能力調控Rta在病毒感染細胞中的量時,再來探討)
基於上述三個成見,我想跟大家討論下面幾個問題:
1. Rta versus G2/M: 歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是我這幾天仔細讀楚穎論文中圖七(B)之flow data,感覺上是有Rta的那一組停在G2/M較多時間(release後8,10h 比較)或是花較多時間進入G2/M(solvent組花6h達78%,Rta組花8h達79%);圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少. Together, it seems to me that cells expressing Rta take longer to prepare for G2/M progression.
2. Rta versus AKT/ERK: Again, from楚穎論文圖七,圖八有Rta的細胞ERK1/2活性是有增加,而且聽說勝彥也有證據說明AKT也會on.所以Rta和mitogenic這條pathway是有影響作用的.但是影響的機致是什麼呢?因為第一段話的第一個成見,所以我比較傾向的推測是(1)會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是因為有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此大多數看到的western blot analysis ERK1/2都是on的.(2)會不會Rta直接down-regulates某個phosphatase的表現(在我們的293TetER中 CDK4/CDK6/CCND1都是顯著被Rta down-regulation)
謅不出來了.提供二篇好文章,大家來腦力激盪一下!有想法盡量po上來,每個人貢獻一點積少定能成多! 下回見. ERK與cell cycle; PI3K/Akt與cell cycle.This one is also good!
1. Is Rta functional in the cytoplasm? Maybe, but most of the time Rta is working hard in the nucleus.表現量過多,過快,或是一邊進核一邊在胞質內"到此一遊留點紀念"的功能不是今天討論範圍.同理RtaNLSm在我心目中是一個細胞質蛋白,它的主要活性與核內的Rta應是截然不同的.
2. Does over-expression of Rta lead to MN formation in EBV-ve cells?是的,在楚穎論文裡,所算的p值都是許多次實驗重複驗證而成.據聞旻潔加做的synchronize細胞也可觀察到許多multinucleated, binucleated, and mis-segregated cells.
3. Does Rta-mediated MN formation contribute to NPC tumorigenesis?傾向不是.因為在有病毒genome存在下,Rta和其所活化的病毒蛋白會造成細胞停止生長或是凋亡.也就是說 cell cycle還走不到anaphase可能就死了(這個議題應在等我們有充份能力調控Rta在病毒感染細胞中的量時,再來探討)
基於上述三個成見,我想跟大家討論下面幾個問題:
1. Rta versus G2/M: 歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是我這幾天仔細讀楚穎論文中圖七(B)之flow data,感覺上是有Rta的那一組停在G2/M較多時間(release後8,10h 比較)或是花較多時間進入G2/M(solvent組花6h達78%,Rta組花8h達79%);圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少. Together, it seems to me that cells expressing Rta take longer to prepare for G2/M progression.
2. Rta versus AKT/ERK: Again, from楚穎論文圖七,圖八有Rta的細胞ERK1/2活性是有增加,而且聽說勝彥也有證據說明AKT也會on.所以Rta和mitogenic這條pathway是有影響作用的.但是影響的機致是什麼呢?因為第一段話的第一個成見,所以我比較傾向的推測是(1)會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是因為有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此大多數看到的western blot analysis ERK1/2都是on的.(2)會不會Rta直接down-regulates某個phosphatase的表現(在我們的293TetER中 CDK4/CDK6/CCND1都是顯著被Rta down-regulation)
謅不出來了.提供二篇好文章,大家來腦力激盪一下!有想法盡量po上來,每個人貢獻一點積少定能成多! 下回見. ERK與cell cycle; PI3K/Akt與cell cycle.This one is also good!
Sep 25, 2008
大概會用吧 再囉唆一下
看到新的回應時,按一下該筆留言最下面的時間和作者(e.g. 2008-09-25-SFL),便可連結到原先發文的原文及所有回應之網頁. 讀完後按一下"首頁"(在最下方中間處)即可回家.另外在網頁最左上方有一個可以search本網誌的搜尋處,善用之可以快速找到你想要的舊資料.是word-search喔,所以只要是content中有的都行.試試"砂石車", "Rta",看看可以找出什麼. 好厲害的Google蠕形動物啊!
Sep 22, 2008
Sep 18, 2008
一日遊報告&大家要去吃安平名產
我和另外四位老師7:45搭九人座小巴出發,吃了一個蘋果二片土司,8:15至竹北THSR,搭上自由席全滿只好加85元升等的441號8:45南下列車,9:49抵台南.出口處又碰到三位老師,一行八人搭上10:05爆滿且有許多人站著還上快速道路,最後把坐我旁邊小弟弟弄得暈頭轉向吐了出來又被阿公責備(弟弟)的接駁公車.10:45抵達統一大樓.11:00開會,12:15吃午餐.13:10~14:20閒聊閒逛.14:30解散.是你,會甘願就這樣回去嗎?? of course not. 於是我和另外二位老師壓迫一位地陪搭小黃到安平附近買了全世界第二好吃的武廟碗粿,永泰興蜜餞,東東蝦餅,喝了一杯兩角銀冬瓜茶,聽運匠阿伯說了一個神奇卻也令人心疼的老師受詐騙集團欺負的故事.這樣一去一返16:10又坐回駛在長榮路上往南徐徐而行的接駁公車上.16:48抵台南THSR,一陣緊湊衝刺之後(全天最刺激處),16:53坐在仍有空位的11號自由席車廂(If you are still reading,給我拍拍手).嘉義站上來了一位威儀極好的僧人,內心一陣清涼...台中站上來的人稍多,開始有人要用站的.18:02扺達高挑雄偉的竹北站,又看到三位出家人,提醒我該念念佛號了,整日心猿意馬地好浪費精力啊.於是在站內候車處出閉目養神一下,18:28等齊了沒趕上同一班車的另一位老師(我沒有被怨,因為..他人很好..嘿嘿),19:00返抵院區.
結論有三:
1)CL的阿桑級招待就是不一樣,我覺得竹南比較像CA的家耶
2)全台灣南北通車的人真的很多,THSR若有股票上市,可以考慮投資
3)台南重要路段紅燈太多,而且應該synchronize一下
提議有一:品嚐完給點意見. 我們把SOP寫出來,下次就可請南部同仁先買好,或宅配時達最佳效果.
結論有三:
1)CL的阿桑級招待就是不一樣,我覺得竹南比較像CA的家耶
2)全台灣南北通車的人真的很多,THSR若有股票上市,可以考慮投資
3)台南重要路段紅燈太多,而且應該synchronize一下
提議有一:品嚐完給點意見. 我們把SOP寫出來,下次就可請南部同仁先買好,或宅配時達最佳效果.
Sep 16, 2008
大人不在,好好顧家&淑真來函
想到什麼可以由台南帶回來品嚐的請留言/簡訊在SFL手機中.真的很想去買那全天下最好吃的碗糕回來,不過據說不是在台南市(憾).是早上就開完會了,所以晚餐前會到家吧. 另外淑真來函喔,竟然鼓吹我去日本開會.說她要入學考了,最怕的是英文這一科..有誰知道她的email嗎,想去跟她打氣一下.謝謝!
Sep 12, 2008
我開學啦~
dear all:
喔 不好意思 讓大家擔心了
我下禮拜又要開學啦 (泣)......
所以禮拜一白天不會出現囉~
會持續到一月左右
阿~ 大家如果有有趣的 適合報告的paper(limit Sep. 2007~Sep. 2008)
請大家告訴我啦^O^~
拜託了^^~
謝謝喔
p.s 請大家出門在外要小心喔 離砂石車遠遠的喔~
YJC
喔 不好意思 讓大家擔心了
我下禮拜又要開學啦 (泣)......
所以禮拜一白天不會出現囉~
會持續到一月左右
阿~ 大家如果有有趣的 適合報告的paper(limit Sep. 2007~Sep. 2008)
請大家告訴我啦^O^~
拜託了^^~
謝謝喔
p.s 請大家出門在外要小心喔 離砂石車遠遠的喔~
YJC
Sep 10, 2008
有請Ingrid或CCL幫忙校正
Dear Ingrid /CCL,
可否抽點空幫忙校正這一段,就是進入各個公司,輸入編號,看看叫出來的東西和我們寫的是否一致. 下次你們的paper會換成讓小蓮及其他人幫忙校對.謝謝！
可否抽點空幫忙校正這一段,就是進入各個公司,輸入編號,看看叫出來的東西和我們寫的是否一致. 下次你們的paper會換成讓小蓮及其他人幫忙校對.謝謝！
Sep 9, 2008
Sep 8, 2008
最近LMP1 papers (匆匆一瞥, 有錯請指正)
剛好看完, 分享一下~
(1) Tsuji et al (2008)
Induction of Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE) by EBV LMP1 and Its Correlation with Angiogenesis and Cervical Lymph Node Metastasis in Nasopharyngeal Carcinoma.
Clin Cancer Res. 14: 5368-75.
--> 阿本仔Furukawa等人新作, 先前研究發現LMP1對Cervical Lymph Node Metastasis與Angiogenesis有所貢獻, 而RAGE這玩意屬immunoglobulin superfamily一員且其overexpression與Metastasis及Angiogenesis相關, 阿本仔examined了42個NPC檢體, 證明了LMP1與RAGE相關, 且LMP1可能透過NFkB路徑活化RAGE, 進而促使NPC之Metastasis跟Angiogenesis ~
(2) Shair et al (2008)
EBV LMP1 effects on plakoglobin, cell growth, and migration.
Cancer Res. 68: 6997-7005.
--> Nancy 等人新作, 沒有tissue與老鼠的研究, 僅靠C666-1之stable clone就上Cancer Res喔!!!不愧是Nancy阿~~~ 此paper發現那些大量表現LMP1的C666-1細胞之growth與migration都比較強喔! 然後PI3K與NFkB路徑對此現象都很重要, LMP1也會抑制plakoglobin(又叫gamma-catenin, 與E-cad結合的東西), 對migration很重要哩 !
(1) Tsuji et al (2008)
Induction of Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE) by EBV LMP1 and Its Correlation with Angiogenesis and Cervical Lymph Node Metastasis in Nasopharyngeal Carcinoma.
Clin Cancer Res. 14: 5368-75.
--> 阿本仔Furukawa等人新作, 先前研究發現LMP1對Cervical Lymph Node Metastasis與Angiogenesis有所貢獻, 而RAGE這玩意屬immunoglobulin superfamily一員且其overexpression與Metastasis及Angiogenesis相關, 阿本仔examined了42個NPC檢體, 證明了LMP1與RAGE相關, 且LMP1可能透過NFkB路徑活化RAGE, 進而促使NPC之Metastasis跟Angiogenesis ~
(2) Shair et al (2008)
EBV LMP1 effects on plakoglobin, cell growth, and migration.
Cancer Res. 68: 6997-7005.
--> Nancy 等人新作, 沒有tissue與老鼠的研究, 僅靠C666-1之stable clone就上Cancer Res喔!!!不愧是Nancy阿~~~ 此paper發現那些大量表現LMP1的C666-1細胞之growth與migration都比較強喔! 然後PI3K與NFkB路徑對此現象都很重要, LMP1也會抑制plakoglobin(又叫gamma-catenin, 與E-cad結合的東西), 對migration很重要哩 !
Sep 6, 2008
EBV 2008 Symposium (更新)
Sep 4, 2008
Sep 3, 2008
當踢館者出現時 我們要冷靜
其實,不太想講太多,但當一個迂迥6次的下游物件(如LMP1)號稱是王道時
Reactivation就聞到PK者出現了 不得不捍衛一下
請問是誰,會讓LMP1大量表現的？是reactivation
是誰,會讓lytic cycle(=GI=王道中的王道)有效產生的？是reactivation
是誰,讓病毒獲得自由,不用一輩子卑微地活在同一個細胞中?也是reactivation
......(冷靜中)......
這一篇和這一篇本是準備給一個失去部份自由的whiterailway君看的
如果LMP1真能和老化聯在一起 那才真的是王道!
......(再冷一次)......
讓我們歡迎 “LMP1才是王道“ (拍掌聲)
Reactivation就聞到PK者出現了 不得不捍衛一下
請問是誰,會讓LMP1大量表現的？是reactivation
是誰,會讓lytic cycle(=GI=王道中的王道)有效產生的？是reactivation
是誰,讓病毒獲得自由,不用一輩子卑微地活在同一個細胞中?也是reactivation
......(冷靜中)......
這一篇和這一篇本是準備給一個失去部份自由的whiterailway君看的
如果LMP1真能和老化聯在一起 那才真的是王道!
......(再冷一次)......
讓我們歡迎 “LMP1才是王道“ (拍掌聲)
向PWW的好記性致敬
Dear PWW,
太強了! 竟然還記得這些clone.
we salute you!
先前誤把K的Zp (labeled as pZp#7)當E-Zp的 wild type
而標示pZp((RZluc(ΔZ))這一管當做E-Zp的mutant在做
所以一直沒有activity. 謝謝妳的"記憶力"
那妳還記得pZp((RZluc(ΔZ)到底是什麼呢?
-by正港老灰阿啦
太強了! 竟然還記得這些clone.
we salute you!
先前誤把K的Zp (labeled as pZp#7)當E-Zp的 wild type
而標示pZp((RZluc(ΔZ))這一管當做E-Zp的mutant在做
所以一直沒有activity. 謝謝妳的"記憶力"
那妳還記得pZp((RZluc(ΔZ)到底是什麼呢?
-by正港老灰阿啦
Sep 1, 2008
Aug 29, 2008
張貼文章時請加標籤
在文章正文框架右下角有一個"Labels for this post"
如果填上作者名稱
那日後你的文章就可以被收集在同一Folder中
當然你用別的像 笑話,Transfection, 命理, KSHV, EBV等也可以
Reactivation有至高無上的權限來保留/刪改之 哈哈哈
Post Options 也很好用
例如可以先打好祝福某人某天生日快樂
等那一天子夜一到 文就Po出了
如果填上作者名稱
那日後你的文章就可以被收集在同一Folder中
當然你用別的像 笑話,Transfection, 命理, KSHV, EBV等也可以
Reactivation有至高無上的權限來保留/刪改之 哈哈哈
Post Options 也很好用
例如可以先打好祝福某人某天生日快樂
等那一天子夜一到 文就Po出了
秋意漸濃
九月份開始
每週二固定和陳老師家的Lab meeting
希望能把握每人不超過15分鐘的原則
做重點式以及抱著和大家分享經驗的心態來做簡報
(也就是說報告覺得對別人也會有用的東西
而不是只是在拖延戰術 倒垃圾 -> 這樣有比較清楚嗎?)
到目前為止各位都做得很好
下個月大家練習一下沒有我事先干涉的情形下
發揮潛力 暢所欲言...
報Paper也可以 那就沒有15分鐘的限制
每週三早上我們可以打鐵趁熱
從九點半到十一點半
每半小時一位到我Office來做細部討論
順序可視情況而互相對調/借用/整合
原則上是美麗/英格麗/小嬿/小蓮
CCL的題目因和陳家較有關聯
讓我和陳老師商討後再決定時間
這個時段的最高境界是每人進來都跟我說
"沒事, everything is under control!"
我會請你們喝咖啡地...
除星期三外 我每天在早上10:30左右會去Lab尋一下
處理House-Keeping或緊急之事
(10:30沒出現? 那就是沒出現)
(其它時間出現? 把他當路人,你還是繼續做你的事就對了)
其它時間要討論實驗的話也很歡迎喔
不過請先預約時間
這樣幫助我較快進入你所碰到的狀況
Now, Open for Comments!
每週二固定和陳老師家的Lab meeting
希望能把握每人不超過15分鐘的原則
做重點式以及抱著和大家分享經驗的心態來做簡報
(也就是說報告覺得對別人也會有用的東西
而不是只是在拖延戰術 倒垃圾 -> 這樣有比較清楚嗎?)
到目前為止各位都做得很好
下個月大家練習一下沒有我事先干涉的情形下
發揮潛力 暢所欲言...
報Paper也可以 那就沒有15分鐘的限制
每週三早上我們可以打鐵趁熱
從九點半到十一點半
每半小時一位到我Office來做細部討論
順序可視情況而互相對調/借用/整合
原則上是美麗/英格麗/小嬿/小蓮
CCL的題目因和陳家較有關聯
讓我和陳老師商討後再決定時間
這個時段的最高境界是每人進來都跟我說
"沒事, everything is under control!"
我會請你們喝咖啡地...
除星期三外 我每天在早上10:30左右會去Lab尋一下
處理House-Keeping或緊急之事
(10:30沒出現? 那就是沒出現)
(其它時間出現? 把他當路人,你還是繼續做你的事就對了)
其它時間要討論實驗的話也很歡迎喔
不過請先預約時間
這樣幫助我較快進入你所碰到的狀況
Now, Open for Comments!
Aug 27, 2008
about luciferase assay
Dear all:
小女子深受luciferase assay的internal control困擾
所以上網找其他人有沒有這類的東西
看到了一個網址
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/11321.html
可是這個人的問題是他的internal control會降低
跟我的不太一樣
後面有個人(doles)有建議 可以試試看phRL vector
是個合成的RL, 據說比較不會受到non specific的activator 影響
而且我剛剛又去看了一下珮雯學姊的論文
他用的就是Promega的phRL-TK
是因為這個原因所以他做起來才不會受影響嗎?
請老闆大人提示~~~~
謝謝
小女子深受luciferase assay的internal control困擾
所以上網找其他人有沒有這類的東西
看到了一個網址
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/11321.html
可是這個人的問題是他的internal control會降低
跟我的不太一樣
後面有個人(doles)有建議 可以試試看phRL vector
是個合成的RL, 據說比較不會受到non specific的activator 影響
而且我剛剛又去看了一下珮雯學姊的論文
他用的就是Promega的phRL-TK
是因為這個原因所以他做起來才不會受影響嗎?
請老闆大人提示~~~~
謝謝
本實驗室開國功臣前助理PWW的MV
恭喜王沛文即將在本月底公開宴客
據可靠消息指出
以下網址有放上兩人甜蜜婚紗MV
歡迎大家觀賞
並獻上祝福
PS 音樂很好聽喔
http://www.wretch.cc/blog/RegulusWang/13107967
據可靠消息指出
以下網址有放上兩人甜蜜婚紗MV
歡迎大家觀賞
並獻上祝福
PS 音樂很好聽喔
http://www.wretch.cc/blog/RegulusWang/13107967
明天星期四的大meeting
已與陳老師說過會晚一點到
會議在十二點前應會結束
所以來到這還趕得上開會
不過天有不測風雲
萬一遲到了 陳老師家的人會先cover!
三個Summer會接力講三部份東西
第一 亞大簡介
第二 60天來所學回顧
第三 請她們幫忙找Rta,p53,NFKB等等 binding site 的結果
正在請總務處的小姐幫忙找看有沒有小一點size的長袖運動衫
讓她們帶回去作紀念 還有會請志宇在她們上台時幫忙照相(每人一張)
萬一拖太久 原則上嬿如先上 再宛樺
好快喔 夏天就要過去了
會議在十二點前應會結束
所以來到這還趕得上開會
不過天有不測風雲
萬一遲到了 陳老師家的人會先cover!
三個Summer會接力講三部份東西
第一 亞大簡介
第二 60天來所學回顧
第三 請她們幫忙找Rta,p53,NFKB等等 binding site 的結果
正在請總務處的小姐幫忙找看有沒有小一點size的長袖運動衫
讓她們帶回去作紀念 還有會請志宇在她們上台時幫忙照相(每人一張)
萬一拖太久 原則上嬿如先上 再宛樺
好快喔 夏天就要過去了
使用此Blog時...
我喜歡它的簡潔清爽!
可是好像沒有無名快耶
而且看來不是很穩 吃掉我兩段話
建議先type在word
再copy/paste至此處
(符合昨天林宜玲老師的建議 想過了才寫得出來)
(也符合陳美如老師的建議
有些人不太好意思面對老板-會嗎?我不是還蠻和藹的嗎?)
有人已經是Google的blogger了嗎?
先為大家設為member
只有member能下comment. 以上.
可是好像沒有無名快耶
而且看來不是很穩 吃掉我兩段話
建議先type在word
再copy/paste至此處
(符合昨天林宜玲老師的建議 想過了才寫得出來)
(也符合陳美如老師的建議
有些人不太好意思面對老板-會嗎?我不是還蠻和藹的嗎?)
有人已經是Google的blogger了嗎?
先為大家設為member
只有member能下comment. 以上.
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