EBV and KSHV EBV infection HOK

20140812 lab meeting_YCK
由 ingrid 在 二, 08/19/2014 - 10:48 發表 EBV and KSHV EBV infection HOK Ingrid LabMeeting YCK

20140610 Journal club paper

Dear all:
          這次我要報告的論文如下: Differentiation imbalance in single oesophageal progenitor cells causes clonal immortalization and field change
          paper請按我下載

Primary NP cell from CELPROGEN

由 ingrid 在 四, 05/22/2014 - 15:53 發表 EBV and KSHV Cell Lines EBV infection Ingrid

瑞柏代理

網頁 http://www.celprogen.com/index.php?route=product/product&filter_name=nasophary&product_id=2028&path=26_44_45_47 

Celprogen原廠配合的廠商為World Courier。

原廠並無販售coating matrix,所以可能還是建議需要購買它們家的耗材。

20140212 Lab meeting - ingrid

LabMeeting-Ingrid

由 EVKVLIN 在 三, 02/12/2014 - 00:00 發表 LIN Lab 2016 Ingrid LabMeeting YCK

LabMeeting-Ingrid 由 EVKVLIN 在 三, 02/12/2014 - 00:00 發表  LIN Lab 2016   Ingrid   LabMeeting   YCK 2008/09/09 Lab Meeting 心得彙整 Ingrid: (1) Preparation of GST-KR for polyclonal antibodies: protocol okay, 但把benzonase加入resuspending buffer中,而protease inhibitor放在第一次thaw完的lysate中,如果還是很黏的話要在thaw完後sonicate 15~30秒 (2)  366/367EE 有抑制現象!請再repeat一次,並且加入pFA-系列,如果也是抑制：(A) 以IP確認WT,366AA及366EE和HDAC1之interaction(we've bought this ab, didn't we?) (B) 準備做WT,366AA及366EE在293/rKSHV.219之latency disruption (3) 293/綠EBV已槓龜兩次. (4) p21/p27與老化及many others: under control! 2008/09/16 Lab Meeting 心得彙整 Ingrid:366/367EE有抑制現象, Cool. 需repeat pFA-TA系列及western（證明不是因mutant的蛋白質量表現得較少了之故).另外,可否找出先前我給妳讀的二篇paper?忘了是什麼跟Nat Cell Biol p53.謝謝.

20131112 journal club paper

Dear all

這篇是我要在下星期二與大家分享的論文，請查收，謝謝!

會後補充：Bmi1會增加telomerase activity，是藉由增加hTERT promoter表現的調控，但是與在hTERT promoter上的c-myc binding sequences無關。 引用於這篇 與這篇 。                                   
                                                                                                        ingrid

20130828 Lab meeting_Ingrid

(一) Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 2013 Mar;35(3):454-63. 主要是利用NGS技術分析頭頸部癌症臨床檢體，發現突變頻率比較高的基因依序為TP53、NOTCH1、HRAS、PIK3CA、CDKN2A。

(二) HPV與頭頸部癌症的關聯 1. HPV陽性感染的頭頸部癌症病人預後比較好。 2. HPV陽性感染的頭頸部癌症病人的基因突變率比陰性的還要少。 3. HPV陽性感染的頭頸部癌症的腫瘤基因表現比較近似其他種.HPV陽性感染癌症，HPV陰性感染的頭頸部癌症的腫瘤基因表現比較近似肺部鱗狀上皮細胞癌。 4. 頭頸部癌症有多種病毒感染，主要是HPV-16，其他包括HPV(18、92、10、26、53、32、6b)、Herpes virus(HSV-1)、HepB virus與polyoma virus。

20130312 Journal Club Paper

Dear All:
我今天要報告的paper是
The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. 全文請按我下載，謝謝！

02/27 Lab Meeting - Ingrid

1. 比較Imatinib、Dasatinib及Nilotinib對於OSCC cells生長的影響。

2.進行PD173074(FGFR inhibitor)對於OSCC cells生長的影響。發現具有fusion gene的C9細胞的確有受到抑制生長。

3.分享關於DNA定序的演進。

08/15 Ingrid報告

分析akata EGFP-EBV感染NP460hTert之後會發生什麼事 :
1.調整很多條件使感染率提高。
2.Rta及下游基因，以及Zta RNA皆在病毒感染後的細胞有偵測到。
3.但是用WB及IFA仍無法偵測到病毒蛋白質的表現，目前仍在確認中。

5/2 Lab Meeting-ingrid

1.製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體

(1) pGEXHis_cZ :已分裝保存於-80℃冰箱。可用於WB(1:2000)(萍)、IFA(1:2000)(鏸)及免疫組織染色 (1:1000)(鏸)。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop : Q320stop已送給濁水溪代製。另外構築pGEXHis_ER_277E-516V做蛋白質表達。
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop :蛋白質表現量太少(失敗)。
(4) pGEXHis_BALF3 :蛋白質表現量太少(失敗)。

2.使用EGFP當目標基因來測試建立NP460TetR_ER inducible cell lines的條件：用未稀釋的lentivirus病毒液直接感染6小時後移除，細胞發綠光比例接近100%，之後細胞放大後，使用10 ug/ml zeocin作篩選16天，發現未加Dox與有加Dox的綠光比例類似，建議做WB(flag)作確認。

3.萍使用Mini-PROTEAN II multiscreen apparatus (Bio-rad)來進行抗體最佳稀釋倍數的實驗。相關資料在https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/f9ec3085-b590-44c6-9b36-b36876cad466/Mini-PROTEAN_II_Multiscreen_Apparatus

首先置備只有一個well的膠體，樣品量為單一well*20=200ug (萍通常使用量)，轉漬完的NC膜置於裝置內，略將裝置傾斜後，從下面的孔注入600ul抗體稀釋液(避免氣泡)，室溫靜置2小時後，以Tip移除抗體稀釋液，用TBST清洗3次後，將裝置打開把NC膜拿出，進行後續二抗的雜交實驗。

未來的實驗計畫

1. EBV RTA Ab
(1)我自己做會再試試Rosetta-gami2，不然就要換其他plasmid---我看我老公論文換plasmid後，表現量有差 (同時濁水溪丁先生也是這樣建議)。
(2)濁水溪丁先生來看過WB結果，說把ERQ320 plasmid拿回去純化試試看 (若不成功不用錢)，已經將plasmid給他，約估花2-3禮拜。
(3)基龍米克斯也有蛋白質純化的服務，他們公司的post-doc可以幫忙試不同plasmid X 不同compentent=一個條件8000元，不成功(蛋白質產量未達到0.5mg/L)的話要2500元(試劑費)。

2.Zta Ab抗體純化
(1)proteinA/G純化---丁先生說通常是延長抗體保存期限，我們保存在-80度應該OK，不過丁先生也不敢一定保證。
(2)antigen column---可提高專一性，但若用(1)純化可得約10-20mg/20ml serum，但用(2)可得2mg/20 ml serum (應該還是會有些抗體掉了)

問過萍學姊，他建議我用NA/TS在做一次，因為他用的是EREV/Dox，本來就會大量表現ZTA，看是不是也是1:5000的稀釋條件是OK的。

PS 萍學姊說他們實驗室都沒有純化抗體，只有應reviewer的建議純化少許抗體作實驗。

3.NP460htert (是不是要先等FY決定題目)
現在實驗室剩
(1)DKSFM+Epi:在去年年底混和好，目前剩有回溫過的150ml+在冷房的200ml (7266元/1L，約等貨14-20天)
(2)KGM-2在20111025購買500ml全新未拆封---冰箱有20ml之前留下來的 (10000元/1L)

PS
(1)有看過宜津的DATA是建議2ng/ml TGF-B作實驗=Dr.曹做NP460_EBVakata的條件
(2)小夏當初TW05EREV---PEG濃縮病毒可以明顯提高感染率，但TGF-B只有一咪咪

自我介紹-ingrid

Hi
大家好
ingrid就是英潔，英潔就是我，我就是ingrid

2/29 Lab Meeting-ingrid

製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(1)的代製抗體已收集，經由細胞lysate測試，證實可以辨認EBV Zta，但akata strain的Zta 的mobility(略低)與細菌表現的不同，接下來要釐清抗體是否有純化，且可否應用於IFA或IP。 (也要釐清是否會辨認B95.8 strain的Zta)
(2)(3)(4)在BL21、DH5α及Rosetta-gami2中，經過調整表達條件，目標蛋白質皆不明顯增多。

1/5 Lab Meeting-ingrid

製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體 (全部已clone成功)
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。
目前採取的策略如下
(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control
(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。
(3) 做BL21及DH5α的competent cell
林同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。

11/09 Lab Meeting-ingrid

1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。

2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3

9/21 Lab Meeting-ingrid

報告Thorley-Lawson DA.在上個月的PLoS Pathogens發表的paper
A Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia.
作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。

8/24 Lab Meeting-ingrid

(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；經更改IP流程，可以有效率以KR(660) from ICON將KR抓下(ERKV_Dox48h)，但是之後應用於ERKV_shLuc_Dox48h、ERKV_shOGTA1_Dox48h及ERKV_shMGEA5B2_Dox48h，卻效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。目前持續改進IP流程中。Note:如果是要看KR蛋白質，建議Lysis buffer要加phosphotase inhibitor以避免KR的碎裂。

(2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(星號應水平標誌)。

(3) 經由計算細胞生長速率及考慮表現Luc蛋白質的程度，混合細胞得到TW01TetLuc pool :#2+ #8及TW05TetLuc pool:#1+ #3+ #5。

(4) 三種Flag Ab測試(Sigma F1804舊、Cell Signaling及Sigma F1804新)：認識Luc蛋白質在TW01TetLuc pool及TW05TetLuc pool的titer皆差不多，除了Cell Signaling背景比較髒。

7/13 Lab Meeting-ingrid

(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；結果是可以成功以KR(660) from ICON將KR抓下，但是效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。接下來會以重收細胞(以EBC Buffer溶解細胞)、增加cell lysate或KR(660)的量來改進IP效率。NOTE：以6% SDS-PAGE分析；KR(Ueda)會認到2條band?
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。結果發現ACTIN primer會影響，但GAPDH不會影響。經重複實驗，排除off-target作用。
(3) TW01TetLuc有4株clones及TW05TetLuc有4株clones進行WB (Flag Ab) 確認為positive。接著進行計數細胞，將生長速率差不多的細胞混合。NOTE：Flag Ab是否有問題?

6/22 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收細胞計數螢光比例(第4次實驗)。發現綠螢光的細胞佔全部細胞約80-85%；紅螢光的細胞佔綠螢光細胞約30%(Dox)、5-10%(NC)、30%(shLuc)、40-50%(shOGT-A1)及65-70%(shMGEA5-B2)。收lysates進行WB確認。且用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。由於結果無法排除off-target作用，進行或重複實驗以確認。
(3) TW01TetLuc有2株clones及TW05TetLuc有8株clones進行IFA (Flag Ab) 確認。由於背景值太高，無法確定是否有Luc蛋白質表現，故進行WB以確認。

5/25 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。
(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。
(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。