2011121 Lab meeting-蔡小丸

日前投稿至Frontiers in Virology的manuscript的初次結果為minor revised
報告三個reviewers的建議, 重點摘要如下:
1. 針對NLS提問, 希望我們討論為何與過去發現不同 (no.1 reviewer)
2. 希望能加做分析KSHV viral particle的產生情形 (n0.1-3 reviewers)
3. 希望我們討論CDK9磷酸化KR的其他可能位點, 還有是否有其他CDKs結合 (n0.1-3)
4. 覺得luciferase assay差異不明顯 (n0.1, 2)
5. 關於KR吸引CDK9後影響Poll2下游的轉錄機制的可能假說, 覺得證據非常不足 (no.2)
6. 提到KR會被IgG所直接binding (no.2)
7. 要我們再詳加解釋S634A/S636A與KR 10kDa的差距是否來自於磷酸化改變 (no.2)

12/7 Lab Meeting- 小夏

1. 計數TW05TetER dox treat 1, 2, 3, 4天的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity沒有差異。建議一樣的條件只做LD與ED組別計數3天後的細胞數及測量WST-1 activity。
2. TW05TetER "escapee" 的實驗，設計失敗。
3. Flag抗體建議以Cell Signalling抗體來降低背景值，Rta的訊號(或雜band)用467抗體來證實。
4.在TW05TetER，dox移除後，ER會隨著時間degrate，其程度與Luc相同，24小時已degrate超過一半; 若dox一直存在下，在96小時前ER的表現也都還會在。至於ER隨著時間增加而增加減少或者是持平，將會繼續釐清，將ER的Kinetics確定清楚。
5. TW05EREV的9株clones以Q-PCR來看viral partical的產生，#1, #4. #7有少量particle，#2, 3, 5, 6, 8, 9則沒有偵測到particle的產生。以WB來看#1, #4. #7 lytic protein的表現Zta: 7>1>4, gp350/220: 1, 7 >4; 隨著dox的induction, #1, #4, #7 的cellular protein p63皆下降，p53皆上升。

11/23 Lab Meeting-小嬿

進度報告:

1. 確定ChIP的前置步驟條件:
Cell: 4 x 10^7 cells/ml lysis buffer
Sonication: 45" ON, 45" OFF for 10-12 cycles (depend on cell type)
2. 在TW01-EREV_2716細胞中, 觀察到CTCF在Dox處理24小時後結合在cellular promoters上的量比6hrs與未處理Dox的細胞來得多. 顯示 Rta的出現可能讓CTCF對這些promoter的affinity更好. 但是在EREV8細胞中, 同樣的時間點沒辦法看到類似的情況.

--> 補齊其他cellular promoter的PCR detection.
--> 目前推測TW01EREV-2716走lytic cycle的速度比EREV8來得快, 可能24hr還看不到CTCF在EREV8細胞的變化. 試試在EREV8細胞中觀察48小時的CTCF ChIP.

11/09 Lab Meeting-ingrid

1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。

2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3

2011026 Lab meeting-蔡小丸

1. 測試anti-DDR1 (Sanat Cruz, C-20) IP條件, 發現增加Ab的量, 並沒有增加IP下來DDR1的量
2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件
3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑

2011-2012 Rehearsal, Site Visit, and Retreat

2011/10/6–7 Rehearsal
2011/10/29–30 Scientific Review/Site Visit
2012/2/17–18 PI Retreat

Review Member:
鄭院士、龔院士、楊院士、劉院士、閻校長、洪院士、院長、王副院長

PI 23 RA/postdoc 20

Director Chang JY
Drug discoverypast 3-yr publication
HuR bind to HIF1a mRNA stablization (inhibited by MPT0B098)
MPT0B098 decreased cytoplams translocation of HuR
MPT0B292 HDAC6 inhibitor
HDAC6 acetylates a-tubulin
Ca2+ influx STIMI Ac actin
What is the effect of actin acetylation upon STIM1 activation?
nticancer efficacy of PLGA-30
MGMT modulates therapeutic efficacy of platinum drugs with radiation and its clinical significance
2012-02 補遺:

• Cheng Gung 70–80% OrCa patients have betel quid habit, radiotherapy is okay; chemotherapy (cisplatin + EGFR inhibitor or taxol)
• Auro Kinae Inhibitor (a multi-target kinase at 100 nM range)

10/12 Lab Meeting- 小夏

1. TW05TetER的doubling time為22.5hr，與TW05TetLuc差不多，繼續持續觀察。將計數long-time treatment的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity。
2. 設計TW05TetER做 "escape" 的實驗。
3. The expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
a. 在12-96hrs之間看不出kinetics，首先將找出Flag抗體的最佳條件，將Flag-ER壓出。
b. Dox induce 24hr之後wash off之後看12hr至72hr protein的degradation，結果Rta確實隨著時間degradate，但預設應該沒有變化的Luc72hr 卻也detect不到任何訊號，猜測也許是沒有加到dox(?)，將另一批sample lysis來確認這件事情。
4. Establishment of TW05EREV
目前有9株clones，1號細胞株先以Dox或TS induce 48hr以IFA看viral protein的分布比例; 及Q-PCR來偵測viral partical。IFA結果 Flag-Rta每一顆細胞都有，Q-PCR結果viral partical 偵測不到。未來screen clones看induction time 為72hr之後，先以Q-PCR來看viral partical是否有出來為主。

09/28 Lab Meeting-小嬿

學姐, 教師節快樂!!

進度報告:
1. 利用Chromatin IP的sample做IP-WB測試CTCF/Flag/Rta抗體使用量:
(1) CTCF使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳
(2) Flag使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳, 但抗體未完全bind在磁珠上, 可再降低抗體量
(3) Rta抗體(Argene)黏附於磁珠的效果不佳, 所抓到的Rta量也不多
--> 確定sonication條件之後就可以上述兩個較好的抗體做ChIP!

2. 測試Akata-EGFP/EBV產出的病毒infect HEK293細胞的效率
(1) 以IgG-48hrs的效果最好, 但所看到GFP(+)的細胞大部分都不健康-->調整病毒濃縮的倍數, 看看是不是病毒太多, 或PEG太多讓細胞有毒性
(2) 將infect 48hrs的細胞收下測得微弱的Rta跟size較小的Zta--> Z若未經modification應為29kDa, 用western看到Akata strain的Z約38kDa, 比B95.8大(約36kDa); 而truncated form最小, 約31kDa(推算); 之後可收RNA, 看所測到的Z是否有truncation.

9/21 Lab Meeting-ingrid

報告Thorley-Lawson DA.在上個月的PLoS Pathogens發表的paper
A Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia.
作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。

兩篇有趣的文獻: from Mol Marker Lab

劉醫師和周博士pass給我的paper. Ref 1: EBNA 1 MoAb 2B4 cross-reacts with MAGE4. Ref2: Metformin inhibits NPC cell C666-1 proliferation.

0914 Lab meeting-蔡小丸

1. 著手進行三張tissue microarray的DDR1 staining給分
(1) 依顏色深淺給予: 0-3分
(2) 依tumor所佔區域大小給分: 0-3分
(3) 分部位分開計分 (已完成舌頭, 臉頰)
仍需解決的問題是 tumor part的判別~~需要請教別人 並且再多看一些slide 累積經驗
希望早日完成計分 並進行統計分析
2. 學姊建議整理DDR1相關data, 以利之後的方向

09/07 Lab Meeting- 小夏

A. Whether serum is required for Rta-induced senescent phenotype in TW05tetER
1. 找出positive control沒有出來的原因。
2. 在一直serum free的情況下，dox-induction若有差別，才可以說明serum的重要性。
3. SA-beta-gal stain在9天有部分細胞是negative，像Escapee的細胞，也許時間要抓早一點來減少這些細胞的比率。
B. 接著先完成以下:
To figure out the expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
TW05TetER的doubling time，生長曲線。

08/31 Lab meeing-小嬿

1. to observe whether CTCF interact with EBV Rta by Immunoprecipitation assay
a) in TW01 inducible cell lines, CTCF and Flag-Rta can not be immunoprecipitated by each other. I also tried Flag beads, which are provided by Sigma, both of Flag-Luc and Flag-ER caught CTCF. I can not prove the interaction between CTCF and EBV Rta in TW01 inducible cell lines.
b) in co-transfected HEK293/293FT cell lines(Flag-Luc/ER/KR), CTCF can immunoprecipitate Flag-ER. However, the ratio of each plasmid is unfair, i will adjust the amount of these plasmids (may ignore Luc) and perform this experiment again.

2. to screen 12 putative target genes in CTCF/Flag-ChIP samples
利用Q-PCR的方式, 這12個genes無法在CTCF-ChIP的samples中被偵測到; 但利用一般PCR的方式, 則可偵測到JUN及H19(雖然band很微弱)
a) 在ChIP之前的sonication片段可能太短, 以至於所設計的這些將近500 bp PCR product的primer不能bind上DNA
b) ChIP的效率不好, 在抗體/磁珠/sample量的比例上該做些調整

8/24 Lab Meeting-ingrid

(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；經更改IP流程，可以有效率以KR(660) from ICON將KR抓下(ERKV_Dox48h)，但是之後應用於ERKV_shLuc_Dox48h、ERKV_shOGTA1_Dox48h及ERKV_shMGEA5B2_Dox48h，卻效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。目前持續改進IP流程中。Note:如果是要看KR蛋白質，建議Lysis buffer要加phosphotase inhibitor以避免KR的碎裂。

(2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(星號應水平標誌)。

(3) 經由計算細胞生長速率及考慮表現Luc蛋白質的程度，混合細胞得到TW01TetLuc pool :#2+ #8及TW05TetLuc pool:#1+ #3+ #5。

(4) 三種Flag Ab測試(Sigma F1804舊、Cell Signaling及Sigma F1804新)：認識Luc蛋白質在TW01TetLuc pool及TW05TetLuc pool的titer皆差不多，除了Cell Signaling背景比較髒。

8/17 Lab meeting-蔡小丸

1. 在HEK293細胞中共同表達KR, S634A/S636A, Luc及不同量的Pin1, 結果發現大量的Pin1會造成KR, S634A/S636A, Luc蛋白量的降低, 由於Luc已知不會與Pin1交互作用, 因此大量Pin1可能部份造成細胞general的影響了。
2. IP結果初步看到, KR及S634A/S636A會被sumo-1所修飾, Luc則沒有, S634A/S636A被sumo-1修飾的能力較差, 但仍需進一步實驗確認sumo-1修飾KR及S634A/S636A所扮演的角色。

8/10 Lab meeting

1. The trial of new medium KGM-2 ── comparing with medium DKSFM/EpiLife for culturing NP460hTert:

(1) Cells culturing in KGM-2 showed more like triangle shape rather than elongated morphology as seeding in DKSFM/EpiLife.

(2) Cells culturing in KGM-2 had slower proliferation rate (Doubling time:55.4hrs) than culturing in DKSFM/EpiLife medium (Doubling time:36hrs).

2.Different [Ca2+] treatments for 6 days in KGM-2 medium for NP460hTert

(1) Along the treatment, cells in 2 calcium free treatments showed poor adhesion to the dish (細胞沒有延伸或突觸等的貼附形態出現). *Mortality rate:32% and 35%.

(2) Cells in 0.1mM [Ca2+] showed good adhesion (細胞亦無層疊的現象) and had the lowest mortality rate (11%) among all treaments.

(3) Cells in 0.5mM,1mM and 1.5 mM Ca2+ showed the tendency to cluster and pile up together under high Ca2+ culture.(第四天後細胞堆疊明顯)

(4) Cells in 1.5mM Ca2+ showed the highest mortality rate (48%), almost 50% of the cells were dead at the measuring time. The mortality of 1mM Ca2+ treatment weas 24%, 0.5mM Ca2+ was27%.

(5) After trypisinization, cells didn't look bigger when counting.(通常要準備走上senescence或分化的細胞會變較大)

討論結果:

(1) KGM-2和DKSFM/EpiLife下細胞生長形態的照片因為seeding不均勻的關係，要再重新試驗新種下比較均勻的10cm dish中再照一次。(8/10已重照完畢)

(2) 不同鈣離子濃度的試驗因為細胞種的不均勻可再做一次試驗(等下禮拜一母盤有夠多的細胞)，而其中一個無鈣離子的對照組可改為0.05mM來試驗(0.1mM still a little bit high or not?!)

(3) 下禮拜可以使用不同濃度的retinoic acid treatment!(in medium DKSFM/EpiLife or KGM-2)，可試試看曹老師用serum來促進differentiation的方法!

08/10 Lab Meeting- 小夏

1. 在TW01TetER及TW05TetER上Serum starvation的條件: 6-well種50000-100000 incubate 48h，serum free組與complete medium組相比，serum free組細胞數少，細胞長得細細長長，在細胞數與細胞型態上有差異性。
補充：根據之前flow data (call cycle analysis) 看48小時的實驗，細胞6-well種100000不至於過滿，200000細胞會過滿。所以我偏愛100000 incubate 48h的condition。接著模仿MB教授的實驗方法看看serum (glucose順道一起看)對Rta-induced cellular senescence.的重要性。(Ref）
2. Establishment of TW05-EREV：
結果：
(1) PEG濃縮病毒可以提高virus infection的效率（5%至20%, combine TGFbeta可達到30%），而TGFbeta則效果不彰。
(2) 細胞先放大至6-cm dish，再種1000顆細胞至10 cm dish進行G418 selection的過程中細胞便死光。
討論：
從12-well放大不要一下就放到6-cm dish中，建議先至6-well較適當。而G418 selection的步驟應該要在細胞放大時就做，防止沒有病毒的細胞勢力擴大。
若現在手邊的細胞已經沒有綠光的存在了，便重新開始以濃縮病毒的方式感染細胞。

NP460hTERT in KGM2

由 sufang 在 三, 08/10/2011 - 14:54 發表 Older Posts EBV infection EBV Rta NP460hTERT transient lytic

2011/08/10 Lab Meeting

1. The trial of new medium KGM-2 ── comparing with medium DKSFM/EpiLife for culturing NP460hTert:

(1) Cells culturing in KGM-2 showed more like triangle shape rather than elongated morphology as seeding in DKSFM/EpiLife.

(2) Cells culturing in KGM-2 had slower proliferation rate (Doubling time:55.4hrs) than culturing in DKSFM/EpiLife medium (Doubling time:36hrs).

2.Different [Ca2+] treatments for 6 days in KGM-2 medium for NP460hTert

(1) Along the treatment, cells in 2 calcium free treatments showed poor adhesion to the dish (細胞沒有延伸或突觸等的貼附形態出現). *Mortality rate:32% and 35%.

(2) Cells in 0.1mM [Ca2+] showed good adhesion (細胞亦無層疊的現象) and had the lowest mortality rate (11%) among all treaments.

(3) Cells in 0.5mM,1mM and 1.5 mM Ca2+ showed the tendency to cluster and pile up together under high Ca2+ culture.(第四天後細胞堆疊明顯)

(4) Cells in 1.5mM Ca2+ showed the highest mortality rate (48%), almost 50% of the cells were dead at the measuring time. The mortality of 1mM Ca2+ treatment weas 24%, 0.5mM Ca2+ was27%.

(5) After trypisinization, cells didn't look bigger when counting.(通常要準備走上senescence或分化的細胞會變較大)

討論結果:

(1) KGM-2和DKSFM/EpiLife下細胞生長形態的照片因為seeding不均勻的關係，要再重新試驗新種下比較均勻的10cm dish中再照一次。(8/10已重照完畢)

(2) 不同鈣離子濃度的試驗因為細胞種的不均勻可再做一次試驗(等下禮拜一母盤有夠多的細胞)，而其中一個無鈣離子的對照組可改為0.05mM來試驗(0.1mM still a little bit high or not?!)

(3) 下禮拜可以使用不同濃度的retinoic acid treatment!(in medium DKSFM/EpiLife or KGM-2)，可試試看曹老師用serum來促進differentiation的方法!

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2 comments:

SFL 8/11/11, 11:21 AM
Yes,as Ingrid pointed out the "old" medium contains Ca2+ at a concentration of (60uM+<100um 0.1mm="" 30="" 50um="" a="" about="" after="" although="" and="" but="" can="" cells="" change="" chronic="" cut="" difference.="" does="" down="" far="" give="" good="" gradually="" if="" ingrid="" it="" make="" may="" natures="" p="" s="" seems="" so="" some="" that="" their="" to="" try.="" um="" we="" while="" why="" worried="" xxum="">

小嬿 8/11/11, 12:50 PM
仲峻學長看過母盤NP460的照片覺得細胞的morphology跟他之前的印象不一樣(現在的細胞比剛recover時更長, 且有些交疊),會不會我們現在用的DKSFM+EpiLife不夠新鮮,導致他變形?(手上medium已經快用完了,將準備新的1L medium~)

Start: 08/10/2011

Timezone: Asia/Taipei

08/03 Lab Meeting-小嬿

進度報告
1. 在HEK293分別做Flag-Luc/ER/KR/gZ的transient transfection 24hrs,
a. IP CTCF: 1/6 of IP中, WB CTCF未有band-->用5/6的memebrane check again;
5/6 of IP中看到ER (by 467), 微弱的gZ(by 4F10), 未見KR(by Yoshi's);
b. IP Flag: 失敗! 1/20 of IP可見Flag蛋白被IP下來, 但未見CTCF!
@WHT建議二抗濃度可再做調整, 讓background更乾淨(e.g. ~100 kD的band)
@在TW01系統試試看!
@SFL建議在293FT做transfection效果更佳! (plus co-co-co-transfection!)
2. 利用ChIP分析TW01TetER_16細胞中, 在Dox induction的狀況下, CTCF所binding的DNA fragment量是否有所改變
-->依據Q-PCR結果顯示, input DNA量不穩定, 影響CTCF IP的數值計算; mock(IgG) IP所得DNA量較少, Ct值SD非常大
@SFL建議做少一點sample量, IP CTCF和Rta, 並且screen先前擬定偵測的gene


GOGOGO! 往PLoS Pathogen邁進!!!

生技醫藥國家型計畫NRPB誠徵生力軍

This job recruitment is closed. Thank you very much for your interest.

0720 Lab meeting-蔡小丸

1. 在293FT細胞中共同表達K-RTA, S634A/S636A, Luc (control protein)及Pin1, 結果發現Pin1降解K-RTA及S634A/S636A的能力相似
2. 用一批新抽的K-RTA及S634A/S636A transfection至293FT後發現, K-RTA與S634A/S636A穩定性接近, 推測634/636位點磷酸化與否與其穩定性無關
3. 完成oral cancer tissue microarray (BC34011, HN811)之DDR1 IHC染色, 未來將進行DDR1表達量之給分
4. 整理DDR1之ligans-collagens(type1-5)在一些oral cancer tissues中觀察到他們的RNA level有增加的情形, 最後我們認為在口腔癌中, collagen type1及type4為可能較重要的DDR1 ligands

7/13 Lab Meeting-ingrid

(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；結果是可以成功以KR(660) from ICON將KR抓下，但是效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。接下來會以重收細胞(以EBC Buffer溶解細胞)、增加cell lysate或KR(660)的量來改進IP效率。NOTE：以6% SDS-PAGE分析；KR(Ueda)會認到2條band?
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。結果發現ACTIN primer會影響，但GAPDH不會影響。經重複實驗，排除off-target作用。
(3) TW01TetLuc有4株clones及TW05TetLuc有4株clones進行WB (Flag Ab) 確認為positive。接著進行計數細胞，將生長速率差不多的細胞混合。NOTE：Flag Ab是否有問題?

EBV Rta-induce cellular senescence in nasopharyngeal cells

小嬿:

(A) 搞定EBV Rta 對 CTCF 在 genome organization 之影響。

(B) 行有餘力 (and a hobby!): Establishment of TW05-EREV

Jean:

(A) Find out the best differentiation protocol for NP460hTert.

(1) reagents: TGFb, calcium …

(2) markers: p63, MYC…

(3) controls: TW05TetER and TW01TetER #16 cells

(4) Ref: 第一篇，第二篇 , 第三篇…

(B) 行有餘力: Cloning of TW05-EREV (由小嬿、小夏指導)
小夏:
Continue to figure out the effects of Rta in serum or glucose -deprived TW01 and TW05 cells.

07/06 Lab Meeting- 小夏

1. The long-term kinetics (0-6 days) of Rta in Dox-treated TW01TetER
The expression of p53, p21, SFN and p27 were increased in Rta induction. Increasing phosphorylation of H2AX was observed on day5 and day6 after Rta induction.
2. Compare the expression level of p21, SFN, c-Myc, p53 and p63 in Dox-treated TW01TetER and TW05TetER
The expression of p53, p21, and SFN were increased in Rta induction while the levels of c-Myc and p63 were decreased.
3. The cytotoxicity of U0126, Rapamycin and LY294002 on TW01TetER
IC50分別為：U0126 40uM, Rapamycin >10uM, LY294002 60uM
4. Test the effect of serum starvation and no glucose on the cell morphology in TW01TetER and TW05TetER
A. 在50000顆細胞的seeding下，serum starvation 48小時可以觀察到細胞生長停滯(也許是緩慢)。
B. 19號長得比16號快 (48小時內活細胞數會較16號多)，但19號也較16號快死(16號活細胞數較19號多)，我覺得19號代謝較快。
C. 不管是TW01或是TW05，細胞缺少葡萄糖最後會死亡(在第五天觀察)。而在缺乏葡萄糖48小時的情況下再添加葡萄糖回去，細胞可以回復正常生長。
D. Serum與Glucose對細胞的生長都很重要。

RNA-Seq Data USB 1 and 2

2011/07/06_
由 sufang 在 三, 07/06/2011 - 00:00 發表 Older Posts BrCa Dan Robinson RNA-seq USB

2011-07-06

2012-04-09

06/29 Lab Meeting-小嬿

1. 修正sonication條件為30" ON, 30" OFF, 8 cycles, 利用此條件在TW01TetER_16細胞做ChIP. 初步測試myc primer, PCR條件未達到最好: 1) 跑膠結果有很多用剩的primer或dimer; 2) input量很多, 而IP的量很少, 沒有調整好比例; 3) myc-2和myc-3的product跑2% agarose不漂亮
-->end-point PCR 固定template量, 調整input的跑膠量; myc-2 myc-3跑3% agarose gel
-->試試Q-PCR條件

2. 利用Thermo fractionation kit分出TW01TetER_16細胞的nuclear extract做IP, WB結果看到CTCF有抓到疑似Rta的band, 但用Flag抗體IP則看不到CTCF.
-->將Flag-Luc, ER, KR, gZ送入HEK293細胞中表現24 hrs後收lysate做IP, WB結果看到CTCF可抓到明顯的ER(by 467)和微弱的gZ(by 4F10), 抓不到Luc(by Flag)和KR(by Yoshi's Ab); 但用Flag IP, 則在四組細胞中都沒有看到CTCF.

To ship RNA sample without dry ice

2011/06/28 To ship RNA sample without dry ice
由 sufang 在 二, 06/28/2011 - 10:19 發表 Older Posts RNA-seq shipping RNA samples

This is an old post from sophia at 仲彥老師's lab (sophia).  2011-06-28
There is a new way to preserve samples. In room temperature, not deep freeze in -80C.

http://www.biomatrica.com/rnastable_products.php (not working)
try this one : tinyurl.com/yasox9n2

The tech sounds interesting and is a perfect case for utilizing the wisdom of nature. 

Anhydrobiosis

"Life Without Water", a natural mechanism that prevents degradation.

Some eukaryotic extremophiles, such as tardigrades and brine shrimp, developed a natural biological mechanism called "anhydrobiosis" that enables their survival while dry for up to 120 years. During these extended time periods, DNA, RNA, proteins, membranes and cellular systems are protected and can be revived by simple rehydration.

Biomatrica's core technology transfers the molecular principles of anhydrobiosis to a synthetic, chemistry-based stabilization technology that works by forming a thermo-stable barrier securely around a sample to provide protection against degradation and loss of biological activity, effectively "shrink-wrapping" the sample until ready to use. Aqueous samples are applied directly to the matrix and air dried at room temperature prior to storage. The air-drying process activates the formation of the protective SampleMatrix^® barrier. Samples are recovered by simple rehydration and are ready for immediate use; sample loss and further purification are thus eliminated.

SampleMatrix^®

SampleMatrix^® — Biomatrica's proprietary core technology platform.

Biomatrica^® has developed a proprietary core technology, SampleMatrix, to stabilize and protect biological materials at room temperature without degradation. The SampleMatrix technology was designed by combining extremophile biology that enables long-term survival of organisms in extremely dry environments with synthetic chemistry. By exploiting these unique characteristics, Biomatrica products enable researchers to stabilize biological samples for long periods of time.

Samples are preserved through formation of a protective thermo-stable barrier during a simple air-drying process. Samples are protected from degradation from heat and UV light. Since SampleMatrix is designed to completely dissolve within minutes during sample rehydration, there is complete and rapid recovery of samples without degradation or loss of biological activity. The recovered samples can be used directly for downstream applications without further purification.

• Stabilize and Store Samples
  Biomatrica's products protect sample integrity, thus increasing reproducibility.
• Just add Water for Rapid and Complete Sample Recovery
  SampleMatrix dissolves completely within minutes and samples can be used directly in downstream applications.
• Use Samples Directly in Downstream Applications
  No purification is required since SampleMatrix does not interfere with downstream assays in rehydrated form.

Start: 06/28/2011

生技醫藥國家型計畫NRPB誠徵生力軍

研究主題: Identification of gene fusions in cancer cells by RNA-seq

1. 碩士級研究助理
2. 博士後研究人員

學歷及專長:
生物資訊、資訊工程或相關研究系所畢業
熟悉perl、python、linux、unix，有分析基因體序列經驗者
具備分子生物學、細胞生物學之專業知識者尤佳

工作內容：本計畫含wet-bench及dry-lab兩種性質的工作。合作團隊包括台大癌症研究中心盧彥伸；國衛院癌研所林素芳；中研院資訊科學研究所林仲彥 (工作地點主要在台北；工作待遇依國科會支薪標準，享勞健保)。

應徵碩士級研究助理請下載並填妥此頁問卷;
應徵博士後研究人員請下載並填妥此頁問卷。

應徵方式：請將 (1) 履歷與填妥之問卷 (2)二位以上推薦人之連絡資料 (3)最高學歷論文摘要，逕寄蘇玉芬小姐(suyufen7011@gmail.com) 或是郵寄至『100台北市中山南路七號台大醫院腫瘤醫學部 』。

資料審查通過者則安排進行面談，資料恕不退件。面談時間及地點將以e-mail或電話通知。

6/22 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收細胞計數螢光比例(第4次實驗)。發現綠螢光的細胞佔全部細胞約80-85%；紅螢光的細胞佔綠螢光細胞約30%(Dox)、5-10%(NC)、30%(shLuc)、40-50%(shOGT-A1)及65-70%(shMGEA5-B2)。收lysates進行WB確認。且用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。由於結果無法排除off-target作用，進行或重複實驗以確認。
(3) TW01TetLuc有2株clones及TW05TetLuc有8株clones進行IFA (Flag Ab) 確認。由於背景值太高，無法確定是否有Luc蛋白質表現，故進行WB以確認。

ChIP-Seq皇后網站

Dan介紹的ChIP-Seq皇后網站。 參考一下她的Protocol專區。

0615 Lab meeting-蔡小丸

1. 再次整理Pin1對於K-RTA的影響, 結果顯示Pin1會結合至K-RTA 並且影響K-RTA之穩定性, 而Pin1結合至K-RTA是經由其WW domain, 且isomerase activity也貢獻於pin1與K-RTA之交互作用
2. 此外, S634A/S636A被anti-MPM2結合的能力較差, 表示S634/S636可能是Pin1所結合的位點
3. Pin1對於K-RTA活性的影響 則尚未釐清
4. 完成oral cancer tissue array (OR2081)的DDR1染色

06/08 Lab Meeting- 小夏

1. The long-term kinetics (0-6 days) of Rta in Dox-treated TW01TetER
2. The cytotoxicity of U0126, Rapamycin and LY294002 on TW01TetER
3. Effect of serum starvation on the cell morphology, cell number and cellular hypertrophy

TW01TetER相關

(AC503, Ingrid, 2010-05-18) 6-well plate format (200K/well = 100K/ml)(1) No Dox control of both cells grew similarly before Day4, doubling time約為24h
(2) #7 continued to grow between Day 4 and Day 7
(3) #19 stopped to increase after Day 4 (猜測是第三天換 medium時同時移掉 死細胞)
(4) YLC 將Day 8細胞拿來做SA-b-Gal staining,是positive, 但比例不詳

(AC 263 小夏) 6-well plate format (200K/well = 100K/ml) DNA content analysis @ 48 h
Results: 71% vs. 78% (#7); 72% vs. 84% (#16); 72% vs. 85% (#19)

(AC 278 小夏) 6-well plate format (100K/well = 50K/ml) DNA content analysis @48 h
Results: 49% vs. 57% (#7); 56% vs. 80% (#19)
(AC401, 小嬿) 24-well plate format (10K/well = 25k/ml); 7.5% FBS, 三天補一次Dox
(1) No Dox control of both cells grew fine until Day 6 (i.e. in 24-well plate, 從10K 長到 200/300K都還OK換算為concn就是500K-750K/ml都還可以)
(2) On day 8, both #16 and #19 have dead cells

所以綜合大家的條件若細胞養在 50K/ml, 在前五天估計細胞都不會因太滿而死掉。上圖附上小嬿細心的記數圖表，是八天的結果。

考慮用Bioruptor sonicate你的protein extract

上週末Bioruptor業務幫我們把儀器fix好的同時，也提及許多Lab在置備protein extract的同時，現在都會加一步sonication的步驟。

set at "Low", 5 cycles.

據說這樣才可以充分地把胞膜上面的蛋白質都萃取出來。有做膜蛋白的人要注意一下! 非膜蛋白的人也可以試試看多加這一步驟，protein是不是萃取得更完全。

06/01 Lab Meeting-小嬿

1. 設計12個target gene的CTCF binding site primers. 初步用ERKV及Raji的genomic DNA測試primer, 九組較佳, 三組較弱, 一組沒有p出來. -->後面這四組primer會再做進一步確認condition
2. 利用IP觀察CTCF是否跟Rta有interaction. IP CTCF後有抓到Rta, 但其抓到的量與Dox induction與否沒有關係(偽Rta?). (使用ICON的blocking reagent後, IgG的band有比較乾淨.)
3. 利用Thermo的fraction kit區分TW01TetER-19細胞的cytosol及nuclear protein. PARP1及CTCF乾淨地位於核內; Rta, p53, H3在cytosol有殘留; GAPDH及a-tubulin主要在質; 怪的是PCNA大部分在細胞質.

-->1. 這篇paper指出位於質內的PCNA具有anti-apoptosis的效用(in neutrophil), 或許這是TW01細胞可以serum starvation還如此快樂的原因之一. (而一點點的PCNA在核內就夠DNA replication 用?或大部分細胞在G1 phase, PCNA不用進核工作)
-->2. 試試沛文的fractionation方法
-->3. 試試IP Flag, 看CTCF是否會被抓下來

5/25 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。
(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。
(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。

05/18 Lab meeting-蔡小丸

1. 利用黃老師家學姊提供之unknown cancer tissue sample進行DDR1之IHC練習
2. 試著釐清Pin1對於K-RTA蛋白質穩定性的角色及對於K-RTA transactivation ability的影響
~~但結論仍在一片渾沌中~~
3. DNCDK9對於K-RTA transactivation ability有抑制的效果 但仍不能排除 DNCDK9是全面性抑制了transcription

05/11 Lab Meeting- 小夏

報告：
1. The expression kinetics (0-72 h) of cell cycle regulators and viral immediate-early proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (Rta, EAD, p53, SFN)
2. The cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716: 72hr, IC50=45.76uM
3. Pretreat 20uM U0126 1hr before dox treatment can inhibit activation of MAPK (ERK 1/2), but don’t inhibit EBV reaction in 2716.
討論：
首先先釐清
1. Cell density與cell growth/senescence/death以及 viral reactivation有關
2. Dox conc.還可以降低嗎?
3. TW01TetER senescence的程度? (#16待做….)
3. 將以前做Rapa的實驗找出來看，綠染似乎有較淡，細胞數似乎有多一些，可以看看Rapamycin, LY其他抑制劑也許在Cell background不同的TW01上會有效。
4. 將MB教授的文章好好讀一讀。

05/03 Lab Meeting-小嬿

1. 比較Dox- 和TPA/NaB-treated TW01-EREV-26(ER-high)/2716(ER-medium):
a. the amount of spontaneous lytic and the responses to inducers: 2716 > 26
b. Dox在2716的反應比TS佳, 但在26的反應比TS差
c. 未比較protein expression level
2. 比較Dox-treated TW01-EREV-26/2716(0-6天):
a. viral proteins: Flag-Rta/total Rta與之前結果相同: 26>2716; BZLF1, BMRF, BLLF1在兩細胞株都以類似EREV8的cascade pattern出現, 但表現量2716>26; latent protein, EBNA1在Dox處理後也有稍稍增多的現象, 2716較為明顯
b. viral particles: 24小時未有病毒量的變化, 48小時開始induce出病毒, 26細胞株所產病毒量約在5-10x 10^4/ml, 而2716的72小時約為10^6/ml, 72-144小時的病毒量相差不大
c. cell death associated markers: 目前試了caspase-3及PARP-1. caspase-3的cleavage form在26較多, 但在induce 3天之後便減少(in both cells); PARP-1的pattern類似於caspase-3.
d. cell cycle associated proteins: (G1) CDK4/6, CCND1, CCND3下降; p21, p27, p53, SFN上升; CCNE1變化不明顯; (S) CCNA, E2F1, p-pRb, pRb下降

Future work:
1. 釐清cell death與viral reactivation之間的順序 (by TUNEL assay?)
2. 除了apoptosis之外, 可觀察其他如autophagy相關markers

4/27 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，A1效果比D1好。shLuc的lysates中，OGT的表現隨著時間增加而增加(?)(但Tubulin也隨之增加?)。

(2) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，因結果難以得出結論，故重新hybridize with OGT Ab。

(3)以shLuc、shMGEA5、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24小時後加Dox，再72小時收lysates進行WB確認，似乎引起的lytic reactivation沒有差異或看不出關聯性(與之前做的結果不一樣)。

20110420 Lab meeting-蔡小丸

1. 利用 Nu-PAGE gel跑出的IP結果不佳
2. 整理K-RTA 磷酸化paper投稿至JV後reviewers的意見
3. 結果發現CDK9會磷酸化K-RTA 而 S634/S636是可能的位點 但是加入DRB 不會影響K-RTA的分子量 期望能找到合理的解釋
4. 大量表達Pin1會造成K-RTA蛋白量降低 而Pin1 inhibitor與 shPin1似乎也會影響K-RTA的表達 量 因此Pin1對於K-RTA stability的影響 需要進一步探討 才能定論(不知道是否因為Pin1 inhibitor或shPin1影響polII的activity呢?)

生物安全新規

請大家操作實驗時，要著實驗衣，違者口頭警告三次，之後每次抓到罰鍰NTD 100。

04/13 Lab Meeting- 小夏

To test the effect of U0126 on EBV Rta-induced EBV reactivation on TW01EREV-2716
1. 初步結果72hr 20uM U0126死了一半的細胞 (WST-1 assay)
2. 感覺Dox 48小時活細胞有隨著U0126濃度的增加而增加
3. Dox 72小時細胞全部懸浮於medium，感覺72小時Dox作用效果遠大於U0126。(這樣可以說U0126是擋不住ER的Function? 也許可以像學姊早上說的降低Dox的量)
Next work will
1. Determine the cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716 by WST-1 assay.
2. Confirm the expression kinetics (0-72hrs) of cell cycle regulators and viral proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (ex. SFN,p53)

04/06 Lab Meeting 小嬿

1. 降低細胞數至7.5 x 10^6/ml做sonication的效果仍未達百分百, 將試5 x 10^6/ml的效果

2. 比較TW01TetER(19) Ctrl-24hrs及Dox-24hrs, (1) CTCF bind在H19及SFN promoter的能力似乎相當, 一般PCR及Q-PCR所看到的差距不大 (2) 初步測試Rta也可bind在H19(weak)及SFN promoter上, Q-PCR 確認中

0330 Lab meeting-蔡小丸

1. 利用coexpress Flag-K-RTA及Flag-CDK9的lysates 進行CDK9 IP實驗 結果發現K-RTA, S634A/S636A, NLSm均與CDK9有interaction, K-RTA與CDK9的association較S634A/S636A強 2. Pin1 isomerase mutant K34A與K-RTA大量共同表達 K-RTA的molecular weight並沒有改變, 初步推測 Pin1的isomerase的活性並不會影響K-RTA的molecular weight

3/30 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，B2效果比D2好。shLuc的lysates中，MGEA5的表現隨著時間增加而增加(?)。

(2) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，MGEA5減少最多的B2，所引發的lytic reactivation越強烈。加入Dox也會引起MGEA5表現增加(?)。總之，將D2提高至1/4，再加入2個NC(有shRNA但未加Dox)，重做一次。

03/24 Lab Meeting- 小夏

1. U0126 (MEK1/2 inhibitor) can inhibit EBV Rta induced p21 expression and EBV reactivation in EREV8.
2. caspase 3 is involved in the survival activity of DDR1 in OSCC (在OEC-M1 and TW2.6 中knockdown DDR1看到pro form的減少)。
3. 用autophage marker LC3B看看autophage是否參予著DDR1調控生長的機制。

03/16 Lab Meeting-小嬿

To test Magnetic ChIP method:
1. non-specific band was less than agarose method
2. By using standard end-point PCR analysis, RNA Pol II is able to bind promoters of GAPDH, H19, and SFN; CTCF can bind H19 promoter and weakly on SFN promoter.
3. The problem of sonication efficiency is not dissolved yet.

3/16 Lab Meeting-ingrid

(1) Dox誘導型細胞株的選殖
TW05TetLuc：#1-6測試中
TW05TetER：#2-18的WB有認到ER，重新做IFA以確認表現蛋白質的比例及強弱
TW05TetER/gZ：#1-33測試中
(2) 以SK-N-SH cell、HelaTet、TW03Tet及TW05Tet lysates做OGT Ab的western analysis，用黃老師家的goat二抗，沒有認到目標蛋白質，重買OGT Ab。
(3) 以shLuc、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，B2效果比D2好。

0309 Lab meeting-蔡小丸

1. 共同表達K-RTA與Pin1後發現, 大量Pin1表達會造成 K-RTA降解
2. 初步結果顯示 K-RTA與 Pin1間有交互作用, 但需加入IgG控制組
3. 完成silence DDR1對於口腔癌細胞株生長之影響

03/02 Lab Meeting-小嬿

1. check Q-PCR primers: p21 and SFN-->Workable!
2. ChIP test :
a. antibodies: mouse IgG, CTCF and Flag antibody
b. primers: H19ICR, SFN, GAPDH(coding region)
c. results: (1) the problem of sonication is not dissolved
(2) condition of Q-PCR is not well, but standard end-point PCR is OK
(3) input is not equal. (one of them is disappeared, actually)
(4) the amount of DNA fragment bound by mouse IgG was similar to CTCF
d. Future work:
(1) to try magnetic system by using standard end-point PCR (IgG and CTCF)
(2) to test Q-PCR condition

03/02 Lab Meeting- 小夏

No SFN signal in TW01TetEREV#27 cells may be due to GFP antibody-blocking. (Sorry didn’t think of it, I’ll check the probability)

2/23 Lab Meeting-ingrid

報告進度
(1) TW05TetER：#1-18中，除了#1及#12以外，其餘在IFA中，為FLAG Ab陽性，重複做IFA(點片)以重複確認。
(2) 以SK-N-SH cell lysates做OGT Ab的western analysis，覺得沒有認到目標蛋白質，再以Hela cell lysates當positive control及黃老師家的goat二抗再確認。

2011/02/18 生物醫療性廢棄物專用垃圾桶統計需求調查

紀錄一下:
1. 放置實驗桌上的小型桶: (7個) 直徑12cm 高13cm圓桶;
2. 置於地上的小型桶: (1個) 直徑25cm 高30cm圓桶;
3. 置於地上的中型桶: (2個) 長40cm 寬27cm 高55cm 方桶。

LabLog ID若有更正..

請印出自己的pdf核對一下。我想應該有不少地方是打錯的。請於更正後再還給我來為各位修正! 謝謝大家~

02/16 Lab Meeting-小夏

1. To compare expression levels of various host proteins in TW01-EREV#27 with its parental cell TW01TetER#16.
2. Test p53 and CDK6 antibodies from ICON.

02/16 Lab meeting-蔡小丸

1. CDK9 Kinase assay結果顯示 CDK9會磷酸化K-RTA 而S634/S636是其中一個位點
2. 初步看出來 K-RTA會被anti phospho-Ser/Thr-Pro MPM2所認識 而與 Pin-1間的交互作用仍需進一步證明
3. 完成silence DDR1對於口腔癌細胞株生長的影響 (DOK, HSC-3, OEC-M1, SCC-15, TW2.6)

PLoS ONE 已被接受，恭喜小嬿！

下一步就是弄清楚Rta是怎麼樣一次動到這麼多基因。這一篇我們就可以有完全的主導權囉~ 萬歲！終於擺脫EV/KV互剋、Rta促進pRb degradation的糾纏...謝謝小嬿替Lab Set-Up許多相關的實驗步驟。也恭喜小嬿!!

春聯釋疑

...釋迦牟尼佛在《法華經》裡說：「是法住法位，世間相常住。」任何一個現象都有它的位置，範圍與特性，毫不混亂，世間相就是這個樣子，亦即在日常生活中，我們看到的所有一切現象是法，而法之中有全體的法與差別的法，但是差別的法並沒有離開全體的法；每一法各有各的範圍和特性，而一切法也都有其共同性，在統一的和諧中，不失個別的差異現象，即是法住法位。by 法鼓山聖嚴法師

希望我們抬頭望到這句偈子時，別忘了讓手中正在研究的題目、操作的實驗均能 法住法位、各安其所。心中的思想也是。並恭賀大家 平安順事 春風得意！

1/26 Lab Meeting-ingrid

報告進度

(1) TW03Tet：因挑選細胞株TetR表現差，故重新挑選。
TW05Tet：以#4進行接下來的穩定細胞株篩選 (#3、#4及#6送入液態氮)，包括Flag-Luc、Flag-gZ+Rta(1：3)、Flag-Rta

(2)以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。

(3)以SK-N-SH cell lysates當作OGT Ab的positive control，同時確認goat二抗是否可用。

01/26 Meeting 小嬿

Progress Report:


1. The stability of EBV Rta
a. the expression level of RTS-15 and Flag-Rta is similar but slightly higher than Rta-V5.
b. Rta expression level of 6-hr transfection is blocked by MG115 and fragmented into smaller size, and the fragments are stablized by MG115 treatment.
2. The expression level of Akata-EGFP/EBV and Akata-p2089 is similar.
3. Higher titer of viral particles were detected in long-term induction of Akata-EGFP/EBV but the infectivities were decreased.
4. Profiling of TW01-EREV-27
-Induction rate is correlated to cell density. Lower is better.
-to be continued.

0119 Lab Meeting-蔡小丸

報告進度:
1. 利用外送PCDNA3-Flag CDK9, PCMV-Flag2-DN-CDK9及PIRES-hrGFP-cyclin T1進行K-RTA的in vitro kinase assay, 初步看到KRTA被CDK9磷酸化,而DN-CDK9則不具有這樣的能力
2. silence DDR1後對於oral cancer cells生長曲線的影響
希望快快將data補起來!! 加油!!

PLoS One加油~

PLoS ONE的rebuttal pdf 已上傳至nas，有興趣者請自行下載。

01/12 Lab Meeting-蔡小丸

報告英國Sahai先生兩篇collective cell migration的paper。2007年這篇是他們建立3D culture system研究squamous cell carcinoma (SCC)的collective invasion，他們發現，cancer associated fibroblast具有帶領一整群SCC invasion的能力。而cancer associated fibroblast會造成matrix remodeling及”track”的形成，以幫助SCC invasion，而這是經由integrin a3、a5、Rho-ROCK路徑。

2011這篇延續2007年的發現，進一步詳盡探討SCC的collective invasion，他們發現要發生collective invasion時，cancer cell的actomyosin (包含F-actin, phospho-MLC及MyosinⅡa)會reorganization。他們觀察到癌細胞與細胞間的actomyosin的活性都是明顯下降的，並進一步發現DDR1會參與actomyosin活性的調控，而DDR1調控collective invasion與它已知的ligand ”collagen”及它的kinase activity沒有太大的關聯性。利用GST-pull down發現DDR1會與Par3及Par6的PDZ domain形成complex，並進一步影響RhoE的分佈，而影響ROCK driven的actomyosin活性，因此，一但阻斷DDR1/Par3/Par6，SCC的collective invasion則會被中斷。本篇提供了DDR1/Par3/Par6在SCC的collective invasion時可能扮演的角色。

01/12 Lab Meeting-小嬿

報告進度:

1. 偵測Dox-treated TW01-EREV-26/27的
a. viral particles, 似乎隨時間增加, 但infectivity待測
b. viral protein expression pattern比EREV8稍快
c. 27的viral particles production比26高
d. 此次的NaB效果遠比Dox低, 可多試NA或EREV8當positive control, 確定NaB效果
e. 細胞數少的induction efficiency較好

2. ChIP的sonication條件:
fixation mode: suspension
cell conc: 1.5 x 10^7 cells/ml,
sonication vol: 150 ul/reaction
sonication cycle: 30" ON, 30" OFF, for 10 cycles

3. RTS-15與Flag-Rta送入293細胞後的表達量相當, 但加MG115之後未stablize Rta的量