報告進度
(1) TW03Tet有10株細胞株，TW05Tet有8株細胞株，已凍管且收好cell lysates等待Western analysis確認。
(2) 目前要進行的實驗如下
a. 將不同稀釋倍數(0、1、1/2、1/4、1/8、1/16)的pAS-EGFP lentivirus送入293中，48小時後，計數細胞存活及死亡比率，同時跑FLOW。(這次infection時，不從細胞上移除含有polybrene的medium)
b. 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus送入ERKV中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
c. 將OGT Ab的條件抓好。
Dec 30, 2010
Dec 27, 2010
12/22 Lab Meeting-ingrid
報告Hart新作：
(1) 以chemoenzymatic assay及抗體確認histone有O-GlcNAcylation
(2) 以LC MS/MS定義出histone上有被O-GlcNAc修飾的位點：Ser47 of H4、Ser36 of H2B和Thr101 of H2A
(3) Heat shock(45℃，1hr)及後續的recovery的時候，發現histone的O-GlcNAc程度逐漸提升，同時OGT活性也有緩慢上升
(4) 以MNase chromatin-sensitivity assays檢測發現Heat shock及後續的recovery時候，Chromatin(染色質)會condense
(5) 過量表現OGT會比過量表現GFP的細胞的染色質更加condense
(1) 以chemoenzymatic assay及抗體確認histone有O-GlcNAcylation
(2) 以LC MS/MS定義出histone上有被O-GlcNAc修飾的位點：Ser47 of H4、Ser36 of H2B和Thr101 of H2A
(3) Heat shock(45℃，1hr)及後續的recovery的時候，發現histone的O-GlcNAc程度逐漸提升，同時OGT活性也有緩慢上升
(4) 以MNase chromatin-sensitivity assays檢測發現Heat shock及後續的recovery時候，Chromatin(染色質)會condense
(5) 過量表現OGT會比過量表現GFP的細胞的染色質更加condense
12/22 Lab Meeting-蔡小丸
1. 成功移除OEC-M1內的mycoplasma
2. 比較多株口腔癌細胞DDR1 autophosphorylation的情形 初步結果顯示台灣地區口腔癌細胞株的DDR1 tyrosine phosphorylation的程度較高
3. 一系列K-RTA vs. CDK1,2,6,9的in vitro kinase assay 仍須再試條件 讓結果更明顯 希望會成功!!!
2. 比較多株口腔癌細胞DDR1 autophosphorylation的情形 初步結果顯示台灣地區口腔癌細胞株的DDR1 tyrosine phosphorylation的程度較高
3. 一系列K-RTA vs. CDK1,2,6,9的in vitro kinase assay 仍須再試條件 讓結果更明顯 希望會成功!!!
Dec 21, 2010
12/15 Lab Meeting-小嬿
報告進度:
1. TW01EREV_S無法用SAHA induction成功-->放棄S
2. 所建立的Akata-p2089, 用hIgG沒有辦法induction(by Q-PCR), 在induce 96hrs情況下, 看不到Rta, Zta及EAD表現, 但有少量的gp350/220. 根據之前研究, 可續偵測LMP2A的存在與否.
3. Akata-EGFP/EBV在hIgG induce 48hrs可到達plateau (in sup, by Q-PCR).
4. 目前所建立的35個TW01EREV中, EBV Rta表達量高者似乎無法induction, 僅有TW01EREV-26可用NaB產出較高量的病毒; 在EBV Rta表達中量者中, 挑到1個Dox與 NaB效果相當-TW01EREV-27. 但其induction rate, viral particles等細項仍須confirm.
5. 搜尋其他研究者的ChIP sonication 條件.
1. TW01EREV_S無法用SAHA induction成功-->放棄S
2. 所建立的Akata-p2089, 用hIgG沒有辦法induction(by Q-PCR), 在induce 96hrs情況下, 看不到Rta, Zta及EAD表現, 但有少量的gp350/220. 根據之前研究, 可續偵測LMP2A的存在與否.
3. Akata-EGFP/EBV在hIgG induce 48hrs可到達plateau (in sup, by Q-PCR).
4. 目前所建立的35個TW01EREV中, EBV Rta表達量高者似乎無法induction, 僅有TW01EREV-26可用NaB產出較高量的病毒; 在EBV Rta表達中量者中, 挑到1個Dox與 NaB效果相當-TW01EREV-27. 但其induction rate, viral particles等細項仍須confirm.
5. 搜尋其他研究者的ChIP sonication 條件.
Nov 24, 2010
11/24 Lab Meeting-蔡小丸
1. 除了OEC-M1以外 其他的口腔癌細胞株都沒有mycoplasma的污染
2. 多株口腔癌細胞株DDR1表達量之比較
3. shDDR1及Glivec對於非台灣地區 口腔癌細胞的影響
4. 持續測試OSCCs之DDR1 activity (phospho-Tyrosine status)
2. 多株口腔癌細胞株DDR1表達量之比較
3. shDDR1及Glivec對於非台灣地區 口腔癌細胞的影響
4. 持續測試OSCCs之DDR1 activity (phospho-Tyrosine status)
Nov 20, 2010
Nov 18, 2010
11/17 Lab Meeting 小嬿
1. Establishment of Akata-p2089, TW01EREV-Akata-EGFP cell lines.
2. To test the sonication condition of ChIP.
3. To evaluate the expression level of X protein in 293- and TW01-series cell lines.
2. To test the sonication condition of ChIP.
3. To evaluate the expression level of X protein in 293- and TW01-series cell lines.
Nov 17, 2010
11/17 Lab Meeting- 小夏
報告這篇PAPER
1. LMP1 increases the release of EGFR into exosomes and that purified exosomes containing LMP1 and EGFR are taken up by epithelial, endothelial, and fibroblast cells, leading to the activation of ERK and PI3K/Akt pathways.
2. The ability to detect LMP1 in the exosome pellet harvested from serum of mice carrying the C15 tumor supports a physiological role of LMP1-containing exosomes in NPC.
3. EBV miRNAs have been detected in NPC exosomes.
4. The effects of EBV and LMP1 on exosomes are likely to be important factors in EBV infection through which a small number of cells expressing LMP1 could both modulate the tumor microenvironment and also potentially impact the infected host.
1. LMP1 increases the release of EGFR into exosomes and that purified exosomes containing LMP1 and EGFR are taken up by epithelial, endothelial, and fibroblast cells, leading to the activation of ERK and PI3K/Akt pathways.
2. The ability to detect LMP1 in the exosome pellet harvested from serum of mice carrying the C15 tumor supports a physiological role of LMP1-containing exosomes in NPC.
3. EBV miRNAs have been detected in NPC exosomes.
4. The effects of EBV and LMP1 on exosomes are likely to be important factors in EBV infection through which a small number of cells expressing LMP1 could both modulate the tumor microenvironment and also potentially impact the infected host.
Nov 12, 2010
Nov 11, 2010
11/10 Lab Meeting- ingrid
1. 想要測試Dox對TW01Tet的生長是否有所影響，結果失敗。下次要收短時間測試(如1、2、3天)。
2. 篩選TW03Tet及TW05Tet細胞株。TW03Tet：24株裡有19株長起來；TW05Tet：24株裡有12株長起來。目前皆放在6 well內等待Western blot測試TetR。
3. OGT抗體無法辨認抗原，已重新購買。另外要解決internal control在每個sample中的量皆不相同的問題。
4. 將shMGEA5送入ERKV細胞中，”似乎”可以使發紅光的細胞比例上升，要再進一步詳細確認。
2. 篩選TW03Tet及TW05Tet細胞株。TW03Tet：24株裡有19株長起來；TW05Tet：24株裡有12株長起來。目前皆放在6 well內等待Western blot測試TetR。
3. OGT抗體無法辨認抗原，已重新購買。另外要解決internal control在每個sample中的量皆不相同的問題。
4. 將shMGEA5送入ERKV細胞中，”似乎”可以使發紅光的細胞比例上升，要再進一步詳細確認。
Nov 7, 2010
33 Lines
33 Lines
由 sufang 在 日, 11/07/2010 - 00:00 發表 Pre-published 33 Lines Cell Lines Dan Robinson PAPA PTK profiling RAGE
由 sufang 在 日, 11/07/2010 - 00:00 發表 Pre-published 33 Lines Cell Lines Dan Robinson PAPA PTK profiling RAGE
| Cell Designation | Tissue 1 | Tissue 2 | Morphology | |
| SW-13 | Adrenal gland | cortex, primary small cell carcinoma | Epithelial | |
| T24 | Bladder | transitional cell carcinoma | Epithelial | |
| SW-1353 | Bone | chondrosarcoma | Fibroblast | |
| Saos-2 | Bone | Osteosarcoma | Epithelial | |
| K-562 | Bone Marrow | Chronic myelogenous leukemia | Lymphoblast | |
| Daoy | Brain | desmoplastic cerebellar medulloblastoma | polygonal | |
| SK-N-SH | Brain | Meta: bone marrow neuroblastoma | Epithelial | |
| SK-BR-3 | Breast | Meta: pleural effusion adenocarcinoma | Epithelial | |
| SW620 | Colon | Meta: lymph node colorectal adenocarcinoma | Epithelial | |
| HT-1080 | Connective tissue | Fibrosarcoma | ||
| U251 | Glioma | AdherentFibroblast | ||
| Caki1 | Kidney | Meta: skin clear cell carcinoma | Epithelial | |
| MOLT-4 | Leukemia | ALL | T Lymphoblast | ITK |
| Jurkat | Leukemia | ALL | T Lymphoblast | ITK |
| CEM | Leukemia | ALL | T Lymphoblast | ITK |
| MEG-01 | Leukemia | CML | megakaryoblast, Lymphoblast | ABL1 |
| HL-60 | Leukemia | promyeloblas, acute promyelocytic leukemia | myeloblastic | |
| HepG2 | Liver | hepatocellular carcinoma | Epithelial | |
| A549 | Lung | Carcinoma | Epithelial | |
| NCI-H69 | Lung | Sm Cell Lung Cancer | floating aggregates | |
| Ramos | Lymphoma | Burkitt's lymphoma, EBV - | Lymphoblast | |
| U-937 | Lymphoma | Histiocytic, EBV - | Monocyte | |
| RD | Muscle | rhabdomyosarcoma | spindle cells and large multinucleated cells | |
| SK-OV-3 | Ovary | Meta: ascites adenocarcinoma | Epithelial | |
| Capan-1 | Pancreas | Meta: liver adenocarcinoma | Epithelial | |
| LNCaP | Prostate | Meta: left supraclavicular lymph node carcinoma | Epithelial | |
| SW837 | Rectum | adenocarcinoma | Epithelial | |
| A-431 | Skin | Epidermoid carcinoma | Epithelial | EGFR |
| SK-MEL-28 | Skin | malignant melanoma | polygonal | |
| AGS | Stomach | gastric adenocarcinoma | Epithelial | |
| SW-982 | Synovium | synovial sarcoma | Mixed | |
| HEC-1-A | Uterus | endometrium; adenocarcinoma | Epithelial | |
| HUVEC | Vein | Umbilical Vein Endothelial Cells | BMX, KDR, TEK | |
| Path at iMac: SORTED/2010/2010_PAPA_33Lines.xlsx | ||||
Nov 4, 2010
11/3 Lab Meeting- 小夏
1. EBV Rta induces growth arrest in the G1 phase of cell cycle in TW01TetER cell lines (the effect is #19＞#7).
2. Counting the viable cell by trypan blue exclusion method show that there is no difference between TW01TetER #7 and #19 in the growth rate for the period of 4 days.
3. Briefly introduce the NPC cell lines established from Dr. Chin-Tarng Lin and published in 1990 and 1993.
2. Counting the viable cell by trypan blue exclusion method show that there is no difference between TW01TetER #7 and #19 in the growth rate for the period of 4 days.
3. Briefly introduce the NPC cell lines established from Dr. Chin-Tarng Lin and published in 1990 and 1993.
Nov 3, 2010
10/27 Lab meeting 蔡小丸
整理departmental seminar時 大家的問題與建議
接下來要進行的部分:
1. DDR1是否是constutively active form
2. 延長shDDR1給予時間 觀察細胞反應
3. 不同稀釋之病毒液 是否能有dose的抑制效果 或要選擇不同的shDDR1 clone
4. 加入其他oral cancer cells
接下來要進行的部分:
1. DDR1是否是constutively active form
2. 延長shDDR1給予時間 觀察細胞反應
3. 不同稀釋之病毒液 是否能有dose的抑制效果 或要選擇不同的shDDR1 clone
4. 加入其他oral cancer cells
Nov 1, 2010
10/27 Lab Meeting- ingrid
測試從中研院買來針對OGT及MGEA5的shRNA系統
1. 簡單以質體轉染送入細胞，再做Q-PCR，發現二者都可以成功抑制RNA的表現
2. 包lentivirus感染送入細胞，再做Western blot analysis，發現可以成功抑制MGEA5蛋白質的表現。但OGT抗體尚未抓到條件，所以還未得知是否也有抑制。
1. 簡單以質體轉染送入細胞，再做Q-PCR，發現二者都可以成功抑制RNA的表現
2. 包lentivirus感染送入細胞，再做Western blot analysis，發現可以成功抑制MGEA5蛋白質的表現。但OGT抗體尚未抓到條件，所以還未得知是否也有抑制。
Oct 29, 2010
10/27 Lab Meeting- 小夏
1. The RNAs of TW02, TW03, TW04, TW05, TW06 are ready. The RNAs of HONE1 and TWO1 will be purified on next week.
2. EBV Rta can induce G1 arrest in TW01TetERTA #7, #16 and #19 in my 1st trial (19≧16＞7).
3. So far, to test the inhibition effect of U0126 in ERTA-induced EBV reactivation.
2. EBV Rta can induce G1 arrest in TW01TetERTA #7, #16 and #19 in my 1st trial (19≧16＞7).
3. So far, to test the inhibition effect of U0126 in ERTA-induced EBV reactivation.
Oct 28, 2010
10/27 Lab Meeting- 小嬿
1. Establishment of several stable cell lines: Akata-p2089, TW01EREV-Akata/EGFP, TW03Tet, and TW05Tet. I need YCK's help to screen TW03Tet and TW05 Tet cells. I'll transfer these clones to YCK tomorrow.
2. To test sonication condition of ChIP.
2. To test sonication condition of ChIP.
Oct 25, 2010
10/21 Lab meeting-蔡小丸
繼續報告DDR1 對於台灣的oral cancer cell lines的重要性
並再討論 DDR1 mediated cell growth可能會經由 MAPK surivial pathway
及嚼檳榔和 OSCC大量表達DDR1的關聯性
再度謝謝大家
連三周 被我疲勞轟炸 及給我的寶貴建議
並再討論 DDR1 mediated cell growth可能會經由 MAPK surivial pathway
及嚼檳榔和 OSCC大量表達DDR1的關聯性
再度謝謝大家
連三周 被我疲勞轟炸 及給我的寶貴建議
Oct 14, 2010
10/14 Lab meeting-蔡小丸
報告DDR1 對於 台灣oral cancer cells扮演的角色之相關實驗整理．．
須在加強的部分包含：
導言強調台灣地區口腔癌的特異性．．
Glivec所抑制的一群PTKs 在Glivec使用濃度上的相關性．．
並再討論DDR1在oral cancer cell裡所mediated survival pathway
討論 檳榔對於collagen及DDR1 是否有扮演什麼樣的角色．．
還有 要再有自信一點 講出來！！
下週再繼續．．辛苦大家了．．
須在加強的部分包含：
導言強調台灣地區口腔癌的特異性．．
Glivec所抑制的一群PTKs 在Glivec使用濃度上的相關性．．
並再討論DDR1在oral cancer cell裡所mediated survival pathway
討論 檳榔對於collagen及DDR1 是否有扮演什麼樣的角色．．
還有 要再有自信一點 講出來！！
下週再繼續．．辛苦大家了．．
Oct 8, 2010
09/29 LabMeeting ingrid
報告去英國參加EBV研討會的感想
針對我的POSTER
Dr. Tsao提出以下的問題
1. TW01TetEREVp2089是否產生具有感染性病毒顆粒?(目前無)
2. 有考慮送入Zta做stable clone嗎?(Rta在epithelial cell內比Zta更能夠活化EBV溶裂期)
3. senescence與lytic cycle的關連?
(以下簡述SEL在噗浪的發言 謝謝SFL:)
Senescence大致分兩類,一種是replicative senescence就是telomere越來越短的"自然老化"; 另一類是oncogene-induced的senescence簡稱OIS.我們Rta造成的senescence屬第二型.)
另外報告
1. Dr. Shannon C. Kenny的海報中，提出Na在上皮細胞中會與p53一同誘導lytic protein表現
2. Dr. Tsao的海報中，他們建立了HONE1-EBV、HK1-EBV及NP460htert-EBV細胞株，其中前二者可以產出有感染力的病毒顆粒。送入EBV的方式則是用Akata 細胞株進行cell-to-cell contact方式進行，成功送入EBV的細胞會發綠光，再以TPA加以誘導使其進入lytic cycle以產生病毒。還有說明加入TPA，雖然細胞的綠光會變強，但並不表示一定會產生相對應多的病毒。
針對我的POSTER
Dr. Tsao提出以下的問題
1. TW01TetEREVp2089是否產生具有感染性病毒顆粒?(目前無)
2. 有考慮送入Zta做stable clone嗎?(Rta在epithelial cell內比Zta更能夠活化EBV溶裂期)
3. senescence與lytic cycle的關連?
(以下簡述SEL在噗浪的發言 謝謝SFL:)
Senescence大致分兩類,一種是replicative senescence就是telomere越來越短的"自然老化"; 另一類是oncogene-induced的senescence簡稱OIS.我們Rta造成的senescence屬第二型.)
另外報告
1. Dr. Shannon C. Kenny的海報中，提出Na在上皮細胞中會與p53一同誘導lytic protein表現
2. Dr. Tsao的海報中，他們建立了HONE1-EBV、HK1-EBV及NP460htert-EBV細胞株，其中前二者可以產出有感染力的病毒顆粒。送入EBV的方式則是用Akata 細胞株進行cell-to-cell contact方式進行，成功送入EBV的細胞會發綠光，再以TPA加以誘導使其進入lytic cycle以產生病毒。還有說明加入TPA，雖然細胞的綠光會變強，但並不表示一定會產生相對應多的病毒。
Oct 7, 2010
10/06 Lab meeting 小嬿
介紹在英國看到的兩篇post (from Dr. Tsao)
1. HONE1-EBV可不受外物刺激就自動產生病毒, HK1-EBV 需要外物刺激, NP460hTert-EBV推測是abortive reactivation(未知停在哪). 在TNF-alpha刺激的HK1-EBV, BMRF1的表現量與Qp相反, 似乎與BZLF1的量不成正相關.
2. 有EBV存在的細胞株在營養缺乏的環境下較有利生存
1. HONE1-EBV可不受外物刺激就自動產生病毒, HK1-EBV 需要外物刺激, NP460hTert-EBV推測是abortive reactivation(未知停在哪). 在TNF-alpha刺激的HK1-EBV, BMRF1的表現量與Qp相反, 似乎與BZLF1的量不成正相關.
2. 有EBV存在的細胞株在營養缺乏的環境下較有利生存
Sep 30, 2010
09/29 LabMeeting SFL
1. CTCF是一個疆界蛋白,調控基因體該被轉錄或不該被轉錄的區域。 最近Genome-wide的ChIP-chip或ChIP-sequencing訂出human genome上約有15,000~20,000個CTCF binding sites。
2. EBV和KSHV genome也會被CTCF bind,尤其在KSHV的latecny control region及EBV 的Qp都有被報導過。但是,在此次EBV會議中,聽到二組做此實驗的人在討論由Raji cell中所map出來的區域好像頗有差異。所以參考data時要特別注意。
3.EBV Rta的recognition site究竟為何?CTCF是個典型Zn finger protein(11個finger), 但是Rta卻不像。
2. EBV和KSHV genome也會被CTCF bind,尤其在KSHV的latecny control region及EBV 的Qp都有被報導過。但是,在此次EBV會議中,聽到二組做此實驗的人在討論由Raji cell中所map出來的區域好像頗有差異。所以參考data時要特別注意。
3.EBV Rta的recognition site究竟為何?CTCF是個典型Zn finger protein(11個finger), 但是Rta卻不像。
Sep 22, 2010
Sep 20, 2010
Sep 17, 2010
Sep 1, 2010
09/01Lab meeting 小丸子
整理抑制DDR1的表達對於四組oral cancer cells生長的影響。初步結果發現DDR1 mediated oral cancer cells生長是collagen independently。
Aug 26, 2010
Aug 18, 2010
Aug 13, 2010
08/11 LabMeeting Ingrid
下個月至英國開會Poster內容預演: (1) 簡述 Virapower System。(2) TW01Tet。(3) TW01TetER-7 and -19。(4) TW01-EREVp2089。
Aug 5, 2010
DDR1這個傢伙
細胞飄到有coating collagen的地方, 會依次進行adhesion, spreading, migration三件事。其中collagen的主要對應receptor有ITGA2B1及DDR1兩種, 而且collagen-ITGA2B1之結合與collagen-DDR1之結合是互相獨立的事件,並不會互相競爭或抑制。可是、結合後傳到細胞內的傳遞訊息就會有交互作用:ITGA2B1-collagen走的是FAK signaling這個pathway、讓細胞長出filopodia、攤平。而這個pathway的一些訊息傳遞會受到DDR1-collagen的抑制(Vogel, Wang), 接著發現這個抑制會導致細胞攤不平(Yeh)。
經過一番仔細研究後, 2009年Vogel Group提出, 細胞接觸collagen要adhesion的那一刻, 細胞內actin filament會remodelling、myosin會和actin暫時解離開來,這時如有DDR1在,DDR1的C-terminus會和myosin緊密結合,於是細胞骨架的收縮力(contraction)大於伸張力(protrusion),所以spreading變少、migration變強。這篇文章在討論部份把Wang/Tang的發現安插在: DDR1還有一個功能就是透過抑制細胞內Cdc42的活性,使得ITGA2B1-collagen mediated spreading降低。另一方面,2010年Wang/Tang將昨天小夏報的paper進一步修正為DDR1的N-terminus把E-cadherin緊緊地拴在細胞表面上(與collagen和細胞density均無關),所以細胞-細胞間aggregate得很好,但同時DDR1 kinase的活性也被block住,無法傳signal下去。但是這個結合怎樣被去除掉,以及和細胞spreading, migration間的關連作者則未進一步做說明。
另外哈佛大學韓國人Lee Lab則發表了DDR1是p53活化MAPK/AKT pathways的重要媒介(2003),以及DDR1的表現可增加癌細胞的 chemoresistance (2006)。再來就是oncogene addiction理論, 我們要找個藥抑制DDR1 (這個及這個)。
經過一番仔細研究後, 2009年Vogel Group提出, 細胞接觸collagen要adhesion的那一刻, 細胞內actin filament會remodelling、myosin會和actin暫時解離開來,這時如有DDR1在,DDR1的C-terminus會和myosin緊密結合,於是細胞骨架的收縮力(contraction)大於伸張力(protrusion),所以spreading變少、migration變強。這篇文章在討論部份把Wang/Tang的發現安插在: DDR1還有一個功能就是透過抑制細胞內Cdc42的活性,使得ITGA2B1-collagen mediated spreading降低。另一方面,2010年Wang/Tang將昨天小夏報的paper進一步修正為DDR1的N-terminus把E-cadherin緊緊地拴在細胞表面上(與collagen和細胞density均無關),所以細胞-細胞間aggregate得很好,但同時DDR1 kinase的活性也被block住,無法傳signal下去。但是這個結合怎樣被去除掉,以及和細胞spreading, migration間的關連作者則未進一步做說明。
另外哈佛大學韓國人Lee Lab則發表了DDR1是p53活化MAPK/AKT pathways的重要媒介(2003),以及DDR1的表現可增加癌細胞的 chemoresistance (2006)。再來就是oncogene addiction理論, 我們要找個藥抑制DDR1 (這個及這個)。
Jun 11, 2010
qPCR primer設計相關
發現幾個好site:
1. Invitrogen/ABI.(Click). + NCBI PrimerBlast. (Click)
2. OriGene. (Click)
簡單介紹步驟如下:
1.在NCBI找出gene symbol (e.g. beta actin AND homo應該查到ACTB).
2.到ABI TaqMan gene expression assays 輸入欲查之gene symbol及 limit物種在homo sapiens.
3.Assay search的結果會給你數個result.其中“inventoried"是優先考慮的assay.
4.在任何一個考慮的assay中以新視窗打開"Alignment Map", 其中星號部分即是inventoried assay.右上方有NM_xxxyyxxx Refseq號碼,再以新視窗打開它.然後會出現此assay的詳細資料.讀完後記住assay location 位點,並且找到下方NM_xxxyyxxx Refseq號碼,再次以新視窗打開它,以連到NCBI site.
5.在NCBI網頁上每一筆NM_xxxyyxxx都可自動做Primer3的引子設計工作(on the right "Pick Primers)
6.以assay location位點為中心,左右各減/加100,放入Forward 及 Reverse中.
7.輸入其它條件 and get your primers.
1. Invitrogen/ABI.(Click). + NCBI PrimerBlast. (Click)
2. OriGene. (Click)
簡單介紹步驟如下:
1.在NCBI找出gene symbol (e.g. beta actin AND homo應該查到ACTB).
2.到ABI TaqMan gene expression assays 輸入欲查之gene symbol及 limit物種在homo sapiens.
3.Assay search的結果會給你數個result.其中“inventoried"是優先考慮的assay.
4.在任何一個考慮的assay中以新視窗打開"Alignment Map", 其中星號部分即是inventoried assay.右上方有NM_xxxyyxxx Refseq號碼,再以新視窗打開它.然後會出現此assay的詳細資料.讀完後記住assay location 位點,並且找到下方NM_xxxyyxxx Refseq號碼,再次以新視窗打開它,以連到NCBI site.
5.在NCBI網頁上每一筆NM_xxxyyxxx都可自動做Primer3的引子設計工作(on the right "Pick Primers)
6.以assay location位點為中心,左右各減/加100,放入Forward 及 Reverse中.
7.輸入其它條件 and get your primers.
Jun 1, 2010
-80度冰箱沒辦法長久保存細胞株
為了釐清-80度冰箱是否可以長久保存細胞株
分別解凍
1. 2007/11 293TREx_Flag_KRTA pool
2. 2008/02 HEK293(p5)
3. 2008/03 HONE-1
4. 2008/05 293FT/rKSHV.219(p8)
5. 2008/08 NP460TetR pool
隔天觀察
發現貼附的細胞極少
所以儲存2-3年以上的細胞株解凍效率極差
今天會將上列5株細胞丟棄
呼籲大家
重要的細胞株還是要留1-2管在液態氮儲存
以免滅種
分別解凍
1. 2007/11 293TREx_Flag_KRTA pool
2. 2008/02 HEK293(p5)
3. 2008/03 HONE-1
4. 2008/05 293FT/rKSHV.219(p8)
5. 2008/08 NP460TetR pool
隔天觀察
發現貼附的細胞極少
所以儲存2-3年以上的細胞株解凍效率極差
今天會將上列5株細胞丟棄
呼籲大家
重要的細胞株還是要留1-2管在液態氮儲存
以免滅種
May 13, 2010
垃圾分類-by小夏
以後實驗室垃圾分四類:
1. C-0504 (廢尖銳器具、針頭) 非感染性的尖銳物質，要裝在盒子給阿姨處理(我們一定要裝好不要讓阿姨有受傷疑慮)
2. C-0505 (受污染動物屍體、殘肢及墊料) 我們實驗室不會有所以不討論。
3. C-0507 (口罩、手套、拋棄式實驗衣等) 一般實驗室的垃圾，手套、Tip…… 自己知道沒有感染性，此類不會拿去滅菌。
4. C-0599 (感染性廢棄物混合物) CULTURE ROOM或養菌所產生感染性的垃圾。黃博士說依規定感染性廢棄物24小時內要滅菌。其中玻璃、針頭、刀片等尖銳感染性物質的要好好包好，不可以直接丟垃圾筒，阿姨會收集起來裝在鐵盒裡拿去滅菌在丟掉。Pasteur pipette像我們現在這樣就可以了，但是不要丟進垃圾桶，一樣要整捆包好，讓阿姨可以安全的拿去滅菌，阿姨會將整袋Pasteur pipette裝在她的滅菌鐵盒中滅菌處理。長條型的塑膠PIPPE也要分類排列整齊(我們也有分類了☺)，讓阿姨好處理。
以上四類，撇開第二類，只有第四類是會經過滅菌處理的。還有不管一般還是感染性圾垃桶都要蓋蓋子。 以後阿姨處理完的所有垃圾，還都會蓋上癌研所的章，以示負責!
1. C-0504 (廢尖銳器具、針頭) 非感染性的尖銳物質，要裝在盒子給阿姨處理(我們一定要裝好不要讓阿姨有受傷疑慮)
2. C-0505 (受污染動物屍體、殘肢及墊料) 我們實驗室不會有所以不討論。
3. C-0507 (口罩、手套、拋棄式實驗衣等) 一般實驗室的垃圾，手套、Tip…… 自己知道沒有感染性，此類不會拿去滅菌。
4. C-0599 (感染性廢棄物混合物) CULTURE ROOM或養菌所產生感染性的垃圾。黃博士說依規定感染性廢棄物24小時內要滅菌。其中玻璃、針頭、刀片等尖銳感染性物質的要好好包好，不可以直接丟垃圾筒，阿姨會收集起來裝在鐵盒裡拿去滅菌在丟掉。Pasteur pipette像我們現在這樣就可以了，但是不要丟進垃圾桶，一樣要整捆包好，讓阿姨可以安全的拿去滅菌，阿姨會將整袋Pasteur pipette裝在她的滅菌鐵盒中滅菌處理。長條型的塑膠PIPPE也要分類排列整齊(我們也有分類了☺)，讓阿姨好處理。
以上四類，撇開第二類，只有第四類是會經過滅菌處理的。還有不管一般還是感染性圾垃桶都要蓋蓋子。 以後阿姨處理完的所有垃圾，還都會蓋上癌研所的章，以示負責!
Mar 3, 2010
Feb 22, 2010
Feb 10, 2010
挖係EBV,衝衝衝!
告別牛年,意味者也告別了KSHV。不過愛KV者也別太感傷,這是暫時的。 精確點說,本人只是想把KR部份做個結束,有些東西拖越久就越難收尾,現在應是把phosphorylation及O-GlcNAcylation兩篇推出去的最佳時機,咱們要把握機會。這裡要特別感謝中研院Khoo lab的鼎力相助、Ingrid及Maruko君的鍥而不舍,俗語說“戲棚子下站久了就是你的”,我想我們會成功的。
實驗室這幾年來建立的EV/KV lytic replication system在小嬿鴨子划水的努力下,第一份manuscript也出爐了,請台大幾位老師幫忙看一下,大抵反應還不差。我的構想是這篇文章著重在兩個細胞株的分析。最難但也最重要的部份就是:細胞都爛成這樣子了,到底有多少病毒產出?這部份set-up之後往下我們就會有一個概念→何謂permissive lytic replication。其實文獻上很難找得到像我們現在手上有這麼高比例, 這麼爛的誘導系統。真是破碎得好極了,我喜歡。
小夏一年來幫忙大家做許多“臨門一腳”的工作,這也要好好提出來感恩一下。大家在傳球上籃時如果個個都想當那最後一個投籃者,那麼這個隊伍的分數一定不高。希望大家能享受團隊合作、一起得分的感覺,也希望這個精神能在我們實驗室裡永遠流傳下去。不過,三月間的poster要好好做,趁這個機會理出ER和老化/G1滯留可以做的方向. i.e. 你該對ER大喊一聲: oh, baby, I am back!
現在來談談tiger year的展望。這年裡我們將以EBV為主(70%)口腔癌為輔(30%),先講較具新鮮感的OSCC (oral squamous cancer cell)。目前我們有五株本土OSCC細胞株, cDNAs皆已置備好。我們往下需要profile (by using Q-RT-PCR) 這些細胞株中PTK的表現情形。另外,由Ingrid及小夏製備好的一些蛋白質則想用來偵測各個細胞表現integrin及differentiation狀況。最後就是B藥對這些細胞株毒殺程度及其機制。在EBV方面則可分【夢幻型計畫】及【穩紮穩打型計畫】兩類。前者包括NP460-EREVp2089的建立; Rta在EBV感染primary epithelial cell後6~48小時內表現情形、對細胞有無明顯effect (如誘導老化); Rta遙控viral genome再活化之直接機制等等。後者則包括 TW01-EREVp2089, HONE1-EREVp2089, HeLa-EZEVp2089之建立; microarray結果中cell growth arrest與cytoskeleton reorganization兩大pathway結果之驗證;以及再分析幾種細胞中的transcriptomes表現情形等等。
Tiger年裡會有一個讓大家賺外快的【一百元專區】→凡是為大家報一篇該區中的paper,立即可得新台幣一百元。目前【一百元專區】的貨源就是在本Blog右上角那些不時更新的好文 (啥米,你到現在才注意到…昏)。若都不符合您的胃口,日後我會在nas上另開一個folder,把2010前一些值得大家討論的paper放進去。或者,可email給我你懷有極大熱情的paper,我會以最寬鬆的審核制度讓你放入該區。要讓寫作技巧進步、國際會議上和你的偶像可以交談的祕訣之一就是不斷地讀paper。學習人家怎麼賣他的想法、怎樣organize他的結果。福虎年裡就讓我們初生之犢不畏虎,大家好好加油!財源廣進!
最後, as usual, 財務方面、實驗室整潔、各項運作要特別謝謝大家一年來的幫忙。各位的分憂解勞讓我覺得當老闆還真是幸福啊！祈願Tiger Year大家身體健康、智慧增長、安和豐富、阿彌陀佛 ！(最後四字=無量光、無量壽之吉祥意)
實驗室這幾年來建立的EV/KV lytic replication system在小嬿鴨子划水的努力下,第一份manuscript也出爐了,請台大幾位老師幫忙看一下,大抵反應還不差。我的構想是這篇文章著重在兩個細胞株的分析。最難但也最重要的部份就是:細胞都爛成這樣子了,到底有多少病毒產出?這部份set-up之後往下我們就會有一個概念→何謂permissive lytic replication。其實文獻上很難找得到像我們現在手上有這麼高比例, 這麼爛的誘導系統。真是破碎得好極了,我喜歡。
小夏一年來幫忙大家做許多“臨門一腳”的工作,這也要好好提出來感恩一下。大家在傳球上籃時如果個個都想當那最後一個投籃者,那麼這個隊伍的分數一定不高。希望大家能享受團隊合作、一起得分的感覺,也希望這個精神能在我們實驗室裡永遠流傳下去。不過,三月間的poster要好好做,趁這個機會理出ER和老化/G1滯留可以做的方向. i.e. 你該對ER大喊一聲: oh, baby, I am back!
現在來談談tiger year的展望。這年裡我們將以EBV為主(70%)口腔癌為輔(30%),先講較具新鮮感的OSCC (oral squamous cancer cell)。目前我們有五株本土OSCC細胞株, cDNAs皆已置備好。我們往下需要profile (by using Q-RT-PCR) 這些細胞株中PTK的表現情形。另外,由Ingrid及小夏製備好的一些蛋白質則想用來偵測各個細胞表現integrin及differentiation狀況。最後就是B藥對這些細胞株毒殺程度及其機制。在EBV方面則可分【夢幻型計畫】及【穩紮穩打型計畫】兩類。前者包括NP460-EREVp2089的建立; Rta在EBV感染primary epithelial cell後6~48小時內表現情形、對細胞有無明顯effect (如誘導老化); Rta遙控viral genome再活化之直接機制等等。後者則包括 TW01-EREVp2089, HONE1-EREVp2089, HeLa-EZEVp2089之建立; microarray結果中cell growth arrest與cytoskeleton reorganization兩大pathway結果之驗證;以及再分析幾種細胞中的transcriptomes表現情形等等。
Tiger年裡會有一個讓大家賺外快的【一百元專區】→凡是為大家報一篇該區中的paper,立即可得新台幣一百元。目前【一百元專區】的貨源就是在本Blog右上角那些不時更新的好文 (啥米,你到現在才注意到…昏)。若都不符合您的胃口,日後我會在nas上另開一個folder,把2010前一些值得大家討論的paper放進去。或者,可email給我你懷有極大熱情的paper,我會以最寬鬆的審核制度讓你放入該區。要讓寫作技巧進步、國際會議上和你的偶像可以交談的祕訣之一就是不斷地讀paper。學習人家怎麼賣他的想法、怎樣organize他的結果。福虎年裡就讓我們初生之犢不畏虎,大家好好加油!財源廣進!
最後, as usual, 財務方面、實驗室整潔、各項運作要特別謝謝大家一年來的幫忙。各位的分憂解勞讓我覺得當老闆還真是幸福啊！祈願Tiger Year大家身體健康、智慧增長、安和豐富、阿彌陀佛 ！(最後四字=無量光、無量壽之吉祥意)
Jan 28, 2010
小嬿Progress Report有感
Teacher蔡: (1) Fig 1C western 太髒, not qualified for publication (要改進!). (2) EAD clone 88 is a good one for IFA (3) Akata strain 比 B95-8 transforms B cell 能力弱很多. (3) Dox-treated ERKV中 knock-downKR (siRNA),用以證實ER是透過KR做事... (4) ACIF是做好EBNA1 IFA之唯一良藥. (5)淑君的Blood paper中述及primary infection可有Z, R, 一直到VCA. (6)葉醫師的differentiation系統為Sphenoidal sinus, 並未有un-differentiated cells.
Teacher陳M.-R.: (1) MA 220 is a good antibody for Dox-EREV8 late gene expression (又是Fig 1C!) (2) Mechanism of ER-mediated activation of KR promoter.
Teacher陳J.-Y.: 要做與疾病,癌症有關的為佳!
SFL: (1) 一篇會令人開悟的文章, 這裡.(2) 293的Vitronectin receptor是怪胎 (ITGAVB1). (3)NA中ER的量與EREV8中ER的量是可以比較估算的.
Teacher陳M.-R.: (1) MA 220 is a good antibody for Dox-EREV8 late gene expression (又是Fig 1C!) (2) Mechanism of ER-mediated activation of KR promoter.
Teacher陳J.-Y.: 要做與疾病,癌症有關的為佳!
SFL: (1) 一篇會令人開悟的文章, 這裡.(2) 293的Vitronectin receptor是怪胎 (ITGAVB1). (3)NA中ER的量與EREV8中ER的量是可以比較估算的.
Jan 22, 2010
B292 相關
1/21/2010 (Thu) 第一次討論會議
Speaker 1-北醫劉景平: Structures of 292, J-30, SAHA etc. One OCH3 group in 292 is enough, two OCH3 increases IC50 from 50 nM to 1400 nM; replace with OH increases IC50 from 50 nM to 500 nM. SAHA is a planer structure, quite stable. SAHA is a pan-HDACi, with uM range. B291 is also a pan-HDACi, with 100 nM range. Wishing 292 is more specific.
Speaker 2-程韻靜: Effects of 292 (1/3) inhibits tubulin polymerization in KB cell; (2/3) inhibits tube formation in SH-SY5Y; (3/3) Animal models (CAM, xenograft in H460 58.7% inhibition, orthotopic PANC-1 with Luc expression); Calcium influx was increased in Taxol or J-30 (not as good as Taxol) treated neuronal cells, but neither SAHA nor 292 had effects in calcium influx; While most cells exhibit 50~100 nM IC50, HUVEC is 42 uM and WI-38 is 12 uM (so interesting!!!)
Speaker 3-夏興國: (1) B292 and EMT seemed not have correlation in breast and lung cancer cells (2) B292 and Adhesion: CL1-0 扁平+292 (uM) =扁平. CL1-5 細長+292 (nM)=morphological changes and tubulin disperse.... (但butyrate, TSA, SAHA都能造成相同現象(FAK and paxillin increases) 耶...
Speaker 4-吳仲峻: TWO1 (72 nM), NA (35 nM with EAD 5~10%), HONE-1 (66 nM), HA (42 nM).
------------------------------------------------------------------------------
11/1/09 SFL wrote:
與PrCA/AR有關:Taken together, our studies suggest that HDAC6 regulates AR hypersensitivity and nuclear localization, mainly via modulating HSP90 acetylation.
與Tau有關:To determine the relationship of tau protein and increased tubulin acetylation, we studied the effect of tau on the acetylation-deacetylation of tubulin. Our results indicate that tau binds to the tubulin-deacetylase, histone deacetylase 6 (HDAC6), decreasing its activity with a consequent increase in tubulin acetylation.
有趣, 有趣..
有空要瞭解一下HSP90,就這麼查吧. "hsp90 review AND cell cycle [jour]"
SAHA 相關 Chiang's recent paper [Here].
Speaker 1-北醫劉景平: Structures of 292, J-30, SAHA etc. One OCH3 group in 292 is enough, two OCH3 increases IC50 from 50 nM to 1400 nM; replace with OH increases IC50 from 50 nM to 500 nM. SAHA is a planer structure, quite stable. SAHA is a pan-HDACi, with uM range. B291 is also a pan-HDACi, with 100 nM range. Wishing 292 is more specific.
Speaker 2-程韻靜: Effects of 292 (1/3) inhibits tubulin polymerization in KB cell; (2/3) inhibits tube formation in SH-SY5Y; (3/3) Animal models (CAM, xenograft in H460 58.7% inhibition, orthotopic PANC-1 with Luc expression); Calcium influx was increased in Taxol or J-30 (not as good as Taxol) treated neuronal cells, but neither SAHA nor 292 had effects in calcium influx; While most cells exhibit 50~100 nM IC50, HUVEC is 42 uM and WI-38 is 12 uM (so interesting!!!)
Speaker 3-夏興國: (1) B292 and EMT seemed not have correlation in breast and lung cancer cells (2) B292 and Adhesion: CL1-0 扁平+292 (uM) =扁平. CL1-5 細長+292 (nM)=morphological changes and tubulin disperse.... (但butyrate, TSA, SAHA都能造成相同現象(FAK and paxillin increases) 耶...
Speaker 4-吳仲峻: TWO1 (72 nM), NA (35 nM with EAD 5~10%), HONE-1 (66 nM), HA (42 nM).
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11/1/09 SFL wrote:
與PrCA/AR有關:Taken together, our studies suggest that HDAC6 regulates AR hypersensitivity and nuclear localization, mainly via modulating HSP90 acetylation.
與Tau有關:To determine the relationship of tau protein and increased tubulin acetylation, we studied the effect of tau on the acetylation-deacetylation of tubulin. Our results indicate that tau binds to the tubulin-deacetylase, histone deacetylase 6 (HDAC6), decreasing its activity with a consequent increase in tubulin acetylation.
有趣, 有趣..
有空要瞭解一下HSP90,就這麼查吧. "hsp90 review AND cell cycle [jour]"
SAHA 相關 Chiang's recent paper [Here].
Jan 16, 2010
Jan 7, 2010
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