(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。
(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。
(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。
May 31, 2011
May 23, 2011
05/18 Lab meeting-蔡小丸
1. 利用黃老師家學姊提供之unknown cancer tissue sample進行DDR1之IHC練習
2. 試著釐清Pin1對於K-RTA蛋白質穩定性的角色及對於K-RTA transactivation ability的影響
~~但結論仍在一片渾沌中~~
3. DNCDK9對於K-RTA transactivation ability有抑制的效果 但仍不能排除 DNCDK9是全面性抑制了transcription
2. 試著釐清Pin1對於K-RTA蛋白質穩定性的角色及對於K-RTA transactivation ability的影響
~~但結論仍在一片渾沌中~~
3. DNCDK9對於K-RTA transactivation ability有抑制的效果 但仍不能排除 DNCDK9是全面性抑制了transcription
May 11, 2011
05/11 Lab Meeting- 小夏
報告：
1. The expression kinetics (0-72 h) of cell cycle regulators and viral immediate-early proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (Rta, EAD, p53, SFN)
2. The cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716: 72hr, IC50=45.76uM
3. Pretreat 20uM U0126 1hr before dox treatment can inhibit activation of MAPK (ERK 1/2), but don’t inhibit EBV reaction in 2716.
討論：
首先先釐清
1. Cell density與cell growth/senescence/death以及 viral reactivation有關
2. Dox conc.還可以降低嗎?
3. TW01TetER senescence的程度? (#16待做….)
3. 將以前做Rapa的實驗找出來看，綠染似乎有較淡，細胞數似乎有多一些，可以看看Rapamycin, LY其他抑制劑也許在Cell background不同的TW01上會有效。
4. 將MB教授的文章好好讀一讀。
1. The expression kinetics (0-72 h) of cell cycle regulators and viral immediate-early proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (Rta, EAD, p53, SFN)
2. The cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716: 72hr, IC50=45.76uM
3. Pretreat 20uM U0126 1hr before dox treatment can inhibit activation of MAPK (ERK 1/2), but don’t inhibit EBV reaction in 2716.
討論：
首先先釐清
1. Cell density與cell growth/senescence/death以及 viral reactivation有關
2. Dox conc.還可以降低嗎?
3. TW01TetER senescence的程度? (#16待做….)
3. 將以前做Rapa的實驗找出來看，綠染似乎有較淡，細胞數似乎有多一些，可以看看Rapamycin, LY其他抑制劑也許在Cell background不同的TW01上會有效。
4. 將MB教授的文章好好讀一讀。
May 3, 2011
05/03 Lab Meeting-小嬿
1. 比較Dox- 和TPA/NaB-treated TW01-EREV-26(ER-high)/2716(ER-medium):
a. the amount of spontaneous lytic and the responses to inducers: 2716 > 26
b. Dox在2716的反應比TS佳, 但在26的反應比TS差
c. 未比較protein expression level
2. 比較Dox-treated TW01-EREV-26/2716(0-6天):
a. viral proteins: Flag-Rta/total Rta與之前結果相同: 26>2716; BZLF1, BMRF, BLLF1在兩細胞株都以類似EREV8的cascade pattern出現, 但表現量2716>26; latent protein, EBNA1在Dox處理後也有稍稍增多的現象, 2716較為明顯
b. viral particles: 24小時未有病毒量的變化, 48小時開始induce出病毒, 26細胞株所產病毒量約在5-10x 10^4/ml, 而2716的72小時約為10^6/ml, 72-144小時的病毒量相差不大
c. cell death associated markers: 目前試了caspase-3及PARP-1. caspase-3的cleavage form在26較多, 但在induce 3天之後便減少(in both cells); PARP-1的pattern類似於caspase-3.
d. cell cycle associated proteins: (G1) CDK4/6, CCND1, CCND3下降; p21, p27, p53, SFN上升; CCNE1變化不明顯; (S) CCNA, E2F1, p-pRb, pRb下降
Future work:
1. 釐清cell death與viral reactivation之間的順序 (by TUNEL assay?)
2. 除了apoptosis之外, 可觀察其他如autophagy相關markers
a. the amount of spontaneous lytic and the responses to inducers: 2716 > 26
b. Dox在2716的反應比TS佳, 但在26的反應比TS差
c. 未比較protein expression level
2. 比較Dox-treated TW01-EREV-26/2716(0-6天):
a. viral proteins: Flag-Rta/total Rta與之前結果相同: 26>2716; BZLF1, BMRF, BLLF1在兩細胞株都以類似EREV8的cascade pattern出現, 但表現量2716>26; latent protein, EBNA1在Dox處理後也有稍稍增多的現象, 2716較為明顯
b. viral particles: 24小時未有病毒量的變化, 48小時開始induce出病毒, 26細胞株所產病毒量約在5-10x 10^4/ml, 而2716的72小時約為10^6/ml, 72-144小時的病毒量相差不大
c. cell death associated markers: 目前試了caspase-3及PARP-1. caspase-3的cleavage form在26較多, 但在induce 3天之後便減少(in both cells); PARP-1的pattern類似於caspase-3.
d. cell cycle associated proteins: (G1) CDK4/6, CCND1, CCND3下降; p21, p27, p53, SFN上升; CCNE1變化不明顯; (S) CCNA, E2F1, p-pRb, pRb下降
Future work:
1. 釐清cell death與viral reactivation之間的順序 (by TUNEL assay?)
2. 除了apoptosis之外, 可觀察其他如autophagy相關markers
4/27 Lab Meeting-ingrid
(1) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，A1效果比D1好。shLuc的lysates中，OGT的表現隨著時間增加而增加(?)(但Tubulin也隨之增加?)。
(2) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，因結果難以得出結論，故重新hybridize with OGT Ab。
(3)以shLuc、shMGEA5、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24小時後加Dox，再72小時收lysates進行WB確認，似乎引起的lytic reactivation沒有差異或看不出關聯性(與之前做的結果不一樣)。
(2) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，因結果難以得出結論，故重新hybridize with OGT Ab。
(3)以shLuc、shMGEA5、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24小時後加Dox，再72小時收lysates進行WB確認，似乎引起的lytic reactivation沒有差異或看不出關聯性(與之前做的結果不一樣)。
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