Sample ID (182240):
A(Luc48)B(Luc24off24）Luc小丸子
C(ER48) D(ER24off24) ER小蓮 (p11)
E(KR48) F(KR24off24) KR小丸子(p4)G(EV48) H(EV24off2) EV小嬿I(KV48) J(KV24off24) KV小蓮 (p8)
各細胞maintain者在星期五種三個10公分盤(2.5~3M),
隔週週一,每種細胞seed兩個6孔盤(0.5M/well)培養在不含藥的tet-free medium中。
週二全部加dox。
週三取一盤6孔盤做wash-off步驟。
週四收細胞(五格for RNA,一格for protein)。
小丸子負責三個重複中的第一組,Ingrid負責三個重複中的第二組,小蓮負責三個重複中的第三組。
哪一組細胞送抽RNA做microarray呢?把30個protein sample先抽好做flag,p21,KbZIP, EA-D等測試,看induction及wash-off情形再定。因為要抽RNA,所以所有細胞harvest下來後均勻拍散,全部先放進-80C冰箱待用。5M細胞約可抽出50ug RNA,而我們的需要量是3~5ug左右。
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2008/10/16 SFL wrote:
Purpose: To analyze transcriptome changes modulated by R. (餘略)
Oct 23, 2008
Oct 21, 2008
For CCL Lab Meeting Papers
Oct 17, 2008
祝福逸人當官順利
有空要多留言喔,告訴我們你很威風(或是相反)。分發時抽到能幫助你成長的籤。吃到不好吃的食物就立刻回想起在這裡的種種negative controls。志玲姐姐改走勞軍路線、胃疼不藥而癒、前途光明燦爛!
Oct 13, 2008
深思熟慮的Pol II (10/13 更新)
RNA Polymerase II Pausing 的延伸閱讀
歷史背景介紹(before 2005):1986年Lis實驗室首先發現以chromatin immunoprecipitation (ChIP)偵測RNA Pol II在果蠅Hsp70 promoter(hsp70)的結合位點時,發現雖然還未被heat induction,但hsp70上卻已有Pol II binding.他們進一步以KMnO4 footprinting和nucear-run等解析度較高的技術算出,在未被heat shock的hsp70上 面Pol II結合位點集中在transcription start site下游20~50 nt附近(+20~50).這種RNA Pol II停在+1下游40 nt左右,而且不再往前polymerization的狀態稱為promoter-proximal pausing.因為hsp70被heat shock後transcript的合成的上昇速率高達100~1000倍之多,因此當初認為這應該僅僅是少數的特例之一.在mammalian cell中較為熟知的類似例子有三,分別是c-myc (1992), c-fos(2006), 和junB(2006). Pausing 的另一種含義是elongation受阻,在in vitro實 驗中發現,若加入positive transcription elongation factor b (P-TEFb)那pausing的現象可被大幅解除.P-TEFb是由cyclinT1和CDK9組成.其中CDK9扮演的角色就是 phosphorylate停滯在promoter-proximal pausing上的三種成份:(1)Pol II CTD上的Ser5 (不知道是不是52個repeat上的S5都會被modify) (2)negative elongation factor-DSIF(磷酸化後的DSIF反而變成positive ELF,會與Pol II緊密結合在一起,直到做完transcription後,一起跳海) (3)另一個negative ELF complex叫NELF(由A,B,C/D,E四個subunit組成,磷酸化後的NELF會掉下來,是一個正港的negative elongation factor!) 病毒界有兩個蛋白質是透過與CDK9結合/增加Pol II的elongation及processivity,以彰顯它們transactivation的能力,那就是Tat (HIV) and VP16(HSV).
(正文)2001~2005 年間,tiling-chip在小型genome上成為可行/負擔得起的技術,針對每個基因哪裡到哪裡是它的promoter, transcription start site, splicing site,termination site等等資訊息都很清楚.另外在這段時間內各個物種的transcriptome也已被分析得相當完整.而有關RNA Pol II pausing 的相關研究,首推Bing Ren實驗室發現人類fibroblast genome上,約有5%(~650)的基因具有transcription machinery結合,但卻沒有transcript產生(2005)。 Richard Young實驗室接著發現人類胚胎幹細胞中(embryonic stem cell),也是有許多基因具有Pol II,acetylated H3,H3K4me3等活化marker,但也都沒有transcript被生成,或是具polymerase elongation特有的記號H3K36me3(Jul-2007)。 另外,結合ChIP及tiling chip技術,同一個實驗室在果蠅胚胎突變種Toll10b的genome中發現原來這些不表現mRNA但卻有Pol II結合的基因(~12%,1,614 of 13,448),Pol II大部份被發現停留在+40左右,也就是典型的promoter-proximal pausing狀態(Dec-2007,小嬿seminar paper)。Side-by-side發表的另一篇文章是採用果蠅胚胎細胞株S2為研究材料,這次他們發現約有8%基因有promoter-proximal pausing(Dec-2007)。 綜合對果蠅胚胎發育各階段各基因扮演的角色,和它們expression kinetics的瞭解,這幾個實驗室提出了二個Pol II pausing可能的生物功能(一) active transcriptional repression (二) preparation for rapid activation at later stage of embryongenesis or environmental stimulation.第二種可能性已被今年發表的二篇論文驗證.第一篇發現一半以上有NELF binding 的pomoter其實是屬於可被induction 為high-expression level的基因群(May-2008). 另一篇論文將NELF-B及NELF-E以siRNA方法knock-down後,發現許多基因的表現不升反降,暗示著NELF這群negative elongation factor可能是透過停滯在promoter-proximal site附近,以保持該區chromatin structure處於可隨時被P-TEFb等分子turn-on的狀態.所以許多stress responding gene均可見及Pol II pausing(July-2008).最後這一篇則歸納出promtoer上常見的pausing button(June-2008).
(臆測點1)剛開始吸引我注意的是,NELF-B(Entrez叫它COBRA1)C-端有一段SPSP區域和KRTA的S634~652間非常相像.這種序列是典型會被CDKs磷酸化的位點.雖然Maruko和我不約而同以類似的program猜想五號CDK是最有可能的KR kinase,但現在我想改投九號一票.因為(1)NELF會被P-TEFb(cyclinT1+CDK9)磷酸化而離開pusing site,讓Pol II 往前走; (2)前面提到的Tat和VP16均仰賴CDK9而彰顯其活性; (3)KSHV有一個latent時期表現的gene叫cyclinK ,也被發現和CDK9結合而磷酸化p53上的Ser33.
(臆測點2)為什麼所有的gamma-herpesvirus都用RTA來做latent-lytic switch呢?為什麼RTA/TA domain那麼potent(幾乎贏過所有已測試過的cellular transcription factor的TA domain)?為什麼把RTA家族的a.a. sequence line-up後,大家最相似的部份是在N端DNA-binding domain而非C端的TA domain(可是彼此之間又不能互相swap,互相reactivattion?像ER只認DN-Luc,p21-Luc,而KR只認PAN-Luc, ORF57-Luc)?最棘手的是ER的RRE和KR的RRE都非常degenerate。就算是透過其它結合蛋白來和DNA做contact,二者所依靠的結合蛋白也應該是非常不同。如果把RTAs想像成chromosomal remodeling這一類的蛋白,那它們調節viral gene表現的機制是不是較容易解釋。像小龜加入doxHEp-2TetER後,不到1小時p21表現量就激增;小蓮的細胞老化實驗也顯示,某些基因是同 時被活化、而某一些又是同時被抑制。還有觀察ERKV、EREV8被dox活化,其中一些IE/early蛋白的expression kinetics也是那種一炮衝天的情形,好像前頭有什麼瓶頸似的,現在終於衝破了。那個瓶頸是什麼呢?會是像hsp70被Pol II pausing的狀況嗎?(shouldn't be Flag-ER, cause its expression peaks at 6 hpi, and maintains a stable rate thereafter)
(臆測點3)那麼來看看兩個immediate-early promoter,EBV BRLF1, BZLF1及KSHV RTA, KbZIP(我仿照前頭的寫法,蛋白名稱斜體就是表示該蛋白的promoter)。發現ZEBRA的Jill Countryman最近有一篇J.Virol,非常詳盡地描述BRLF1,BZLF1在接受到這類chemical刺激時,上面histones acetylation的變化情形(Jill是我的美籍學姐,老公是律師,家境優沃,做science是她的興趣,中午一杯yourgot搞定。曾被她唸過一邊聽人演講一邊看自己手上的paper是非常沒有禮貌的行為,從此改掉這個壞習慣)。HH514-16(clone 16)是P3HR1衍生細胞株,可被NaB提引出lytic cycle,但TPA則無效。她發現以三種不同的HDACi (NaB, TSA, VPA)處理clone 16時,BRLF1上的H3,H4均會被acetylated。也就是說Rta的promoter region可被這三種HDACi解開。但奇怪的是,只有NaB和TSA可induce lytic cycle,VPA則不行。好,下一步她反過來用B95-8/Raji這組細胞來做。B95-8/Raji可被TPA或5-Aza-C induce lytic replication,但是HDACi則無效。有趣的是,雖然TPA treated的B95-8有在做lytic replication,可是它的BRLF1/BZLF H3/H4部份卻不見被acetylation。綜合上述兩種結果,BRLF1/BZLF的acetylation與否似乎和走不走lytic cycle無關。那麼,和RNA Pol II pausing有關嗎?(今天有新鮮貝果在後面冰箱,只有讀到這裡的人才知道)。
歷史背景介紹(before 2005):1986年Lis實驗室首先發現以chromatin immunoprecipitation (ChIP)偵測RNA Pol II在果蠅Hsp70 promoter(hsp70)的結合位點時,發現雖然還未被heat induction,但hsp70上卻已有Pol II binding.他們進一步以KMnO4 footprinting和nucear-run等解析度較高的技術算出,在未被heat shock的hsp70上 面Pol II結合位點集中在transcription start site下游20~50 nt附近(+20~50).這種RNA Pol II停在+1下游40 nt左右,而且不再往前polymerization的狀態稱為promoter-proximal pausing.因為hsp70被heat shock後transcript的合成的上昇速率高達100~1000倍之多,因此當初認為這應該僅僅是少數的特例之一.在mammalian cell中較為熟知的類似例子有三,分別是c-myc (1992), c-fos(2006), 和junB(2006). Pausing 的另一種含義是elongation受阻,在in vitro實 驗中發現,若加入positive transcription elongation factor b (P-TEFb)那pausing的現象可被大幅解除.P-TEFb是由cyclinT1和CDK9組成.其中CDK9扮演的角色就是 phosphorylate停滯在promoter-proximal pausing上的三種成份:(1)Pol II CTD上的Ser5 (不知道是不是52個repeat上的S5都會被modify) (2)negative elongation factor-DSIF(磷酸化後的DSIF反而變成positive ELF,會與Pol II緊密結合在一起,直到做完transcription後,一起跳海) (3)另一個negative ELF complex叫NELF(由A,B,C/D,E四個subunit組成,磷酸化後的NELF會掉下來,是一個正港的negative elongation factor!) 病毒界有兩個蛋白質是透過與CDK9結合/增加Pol II的elongation及processivity,以彰顯它們transactivation的能力,那就是Tat (HIV) and VP16(HSV).
(正文)2001~2005 年間,tiling-chip在小型genome上成為可行/負擔得起的技術,針對每個基因哪裡到哪裡是它的promoter, transcription start site, splicing site,termination site等等資訊息都很清楚.另外在這段時間內各個物種的transcriptome也已被分析得相當完整.而有關RNA Pol II pausing 的相關研究,首推Bing Ren實驗室發現人類fibroblast genome上,約有5%(~650)的基因具有transcription machinery結合,但卻沒有transcript產生(2005)。 Richard Young實驗室接著發現人類胚胎幹細胞中(embryonic stem cell),也是有許多基因具有Pol II,acetylated H3,H3K4me3等活化marker,但也都沒有transcript被生成,或是具polymerase elongation特有的記號H3K36me3(Jul-2007)。 另外,結合ChIP及tiling chip技術,同一個實驗室在果蠅胚胎突變種Toll10b的genome中發現原來這些不表現mRNA但卻有Pol II結合的基因(~12%,1,614 of 13,448),Pol II大部份被發現停留在+40左右,也就是典型的promoter-proximal pausing狀態(Dec-2007,小嬿seminar paper)。Side-by-side發表的另一篇文章是採用果蠅胚胎細胞株S2為研究材料,這次他們發現約有8%基因有promoter-proximal pausing(Dec-2007)。 綜合對果蠅胚胎發育各階段各基因扮演的角色,和它們expression kinetics的瞭解,這幾個實驗室提出了二個Pol II pausing可能的生物功能(一) active transcriptional repression (二) preparation for rapid activation at later stage of embryongenesis or environmental stimulation.第二種可能性已被今年發表的二篇論文驗證.第一篇發現一半以上有NELF binding 的pomoter其實是屬於可被induction 為high-expression level的基因群(May-2008). 另一篇論文將NELF-B及NELF-E以siRNA方法knock-down後,發現許多基因的表現不升反降,暗示著NELF這群negative elongation factor可能是透過停滯在promoter-proximal site附近,以保持該區chromatin structure處於可隨時被P-TEFb等分子turn-on的狀態.所以許多stress responding gene均可見及Pol II pausing(July-2008).最後這一篇則歸納出promtoer上常見的pausing button(June-2008).
(臆測點1)剛開始吸引我注意的是,NELF-B(Entrez叫它COBRA1)C-端有一段SPSP區域和KRTA的S634~652間非常相像.這種序列是典型會被CDKs磷酸化的位點.雖然Maruko和我不約而同以類似的program猜想五號CDK是最有可能的KR kinase,但現在我想改投九號一票.因為(1)NELF會被P-TEFb(cyclinT1+CDK9)磷酸化而離開pusing site,讓Pol II 往前走; (2)前面提到的Tat和VP16均仰賴CDK9而彰顯其活性; (3)KSHV有一個latent時期表現的gene叫cyclinK ,也被發現和CDK9結合而磷酸化p53上的Ser33.
(臆測點2)為什麼所有的gamma-herpesvirus都用RTA來做latent-lytic switch呢?為什麼RTA/TA domain那麼potent(幾乎贏過所有已測試過的cellular transcription factor的TA domain)?為什麼把RTA家族的a.a. sequence line-up後,大家最相似的部份是在N端DNA-binding domain而非C端的TA domain(可是彼此之間又不能互相swap,互相reactivattion?像ER只認DN-Luc,p21-Luc,而KR只認PAN-Luc, ORF57-Luc)?最棘手的是ER的RRE和KR的RRE都非常degenerate。就算是透過其它結合蛋白來和DNA做contact,二者所依靠的結合蛋白也應該是非常不同。如果把RTAs想像成chromosomal remodeling這一類的蛋白,那它們調節viral gene表現的機制是不是較容易解釋。像小龜加入doxHEp-2TetER後,不到1小時p21表現量就激增;小蓮的細胞老化實驗也顯示,某些基因是同 時被活化、而某一些又是同時被抑制。還有觀察ERKV、EREV8被dox活化,其中一些IE/early蛋白的expression kinetics也是那種一炮衝天的情形,好像前頭有什麼瓶頸似的,現在終於衝破了。那個瓶頸是什麼呢?會是像hsp70被Pol II pausing的狀況嗎?(shouldn't be Flag-ER, cause its expression peaks at 6 hpi, and maintains a stable rate thereafter)
(臆測點3)那麼來看看兩個immediate-early promoter,EBV BRLF1, BZLF1及KSHV RTA, KbZIP(我仿照前頭的寫法,蛋白名稱斜體就是表示該蛋白的promoter)。發現ZEBRA的Jill Countryman最近有一篇J.Virol,非常詳盡地描述BRLF1,BZLF1在接受到這類chemical刺激時,上面histones acetylation的變化情形(Jill是我的美籍學姐,老公是律師,家境優沃,做science是她的興趣,中午一杯yourgot搞定。曾被她唸過一邊聽人演講一邊看自己手上的paper是非常沒有禮貌的行為,從此改掉這個壞習慣)。HH514-16(clone 16)是P3HR1衍生細胞株,可被NaB提引出lytic cycle,但TPA則無效。她發現以三種不同的HDACi (NaB, TSA, VPA)處理clone 16時,BRLF1上的H3,H4均會被acetylated。也就是說Rta的promoter region可被這三種HDACi解開。但奇怪的是,只有NaB和TSA可induce lytic cycle,VPA則不行。好,下一步她反過來用B95-8/Raji這組細胞來做。B95-8/Raji可被TPA或5-Aza-C induce lytic replication,但是HDACi則無效。有趣的是,雖然TPA treated的B95-8有在做lytic replication,可是它的BRLF1/BZLF H3/H4部份卻不見被acetylation。綜合上述兩種結果,BRLF1/BZLF的acetylation與否似乎和走不走lytic cycle無關。那麼,和RNA Pol II pausing有關嗎?(今天有新鮮貝果在後面冰箱,只有讀到這裡的人才知道)。
Oct 10, 2008
Primary infection of EBV in keratinocytes - the history
2006/10
Molecular and cytogenetic changes involved in the immortalization of nasopharyngeal epithelial cells by telomerase (the link to NCBI)
2008/10/10
這一篇.所以送EBV進入NP460h-hTERT不就等同於把EBV關禁閉?
Dr.George Miller有篇在J.Virol.Methods(2006)的文章,看起來像是一位MD/PhD的學生做的。他以兩位IM病人血清(富含各種anti-EBV抗體)去分離經NaB處理過的P3HR1(HH514)細胞。分什麼呢?分那些在走lytic cycle和不被NaB活化的HH514。分下來後的細胞再送回去petri-dish養。結果發現走lytic cycle的細胞無一存活、而沒有induce的細胞可以再被養回來,而且induction rate隨著時間增加而增加。很有意思的一篇文章。George大學是學歷史的,非常會寫文章,邏輯性很強而且要言不贅,讀他的paper總覺得能做science真好。
Dr.George Miller有篇在J.Virol.Methods(2006)的文章,看起來像是一位MD/PhD的學生做的。他以兩位IM病人血清(富含各種anti-EBV抗體)去分離經NaB處理過的P3HR1(HH514)細胞。分什麼呢?分那些在走lytic cycle和不被NaB活化的HH514。分下來後的細胞再送回去petri-dish養。結果發現走lytic cycle的細胞無一存活、而沒有induce的細胞可以再被養回來,而且induction rate隨著時間增加而增加。很有意思的一篇文章。George大學是學歷史的,非常會寫文章,邏輯性很強而且要言不贅,讀他的paper總覺得能做science真好。
2010/02
MTA_Signed_LinSF_NP460hTERT
2010/08
Epstein-Barr virus infection in immortalized nasopharyngeal epithelial cells: regulation of infection and phenotypic characterization (the link to NCBI)
2012/06
AC944 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial I)
AC957 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial II)
AE003 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial III)
2012/07
AE005 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial IV)
AE011 Primary infection of akata-EBV in NP460hTert (Trial V)
AE015 TW01-ERGV (p3) from Dr. 張堯 YCK 7/28/12
AE016 IFA assay of Dox-treated TW01ERGV-62
hTERT抑制EBV複製及For Phil文章一篇
2008/10/10_hTERT抑制EBV複製及For Phil文章一篇
由 sufang 在 五, 10/10/2008 - 16:40 發表 Older Posts EBV NP460hTERT
Oct 9, 2008
2008 Nobel Prize in Chemistry
Oct 6, 2008
2008 Nobel medicine prize
Oct 3, 2008
又到週末了
那麼,祈願美國經濟不可崩盤,歐盟諸公繼續挺台灣入衛,台灣八點檔連續劇恢復一個鐘頭,青菜水果價格恢復...（喂喂喂,大家多多開文啊,這裡是"Our Thoughts"~寫了不愛還可以自己消掉啊.也許大家都忙著做實驗吧,看來當老闆還是不錯的)下週二Lab meeting時,小嬿要報告RNA Pol II pausing的paper(rehearsal).現在請各位捫心自問:R/Z這些傢伙是怎樣幫忙RNA Pol II做病毒基因轉錄的?
Oct 1, 2008
訊息佈達(更新版/最終話)
On Sep-16-2008 AM 10:00, SFL wrote:
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
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三個成見(二不一會):
1. Rta's function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.
Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.
要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.
再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些"cue"所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2)可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以"盤子滿了,得passage!"的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的"功德".這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK...或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:
Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.
(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21's interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的留下一點痕跡吧!
Dear All, 陳老師在上週三院務會議後,熱切地吩咐我要把Rta造成MN增加的現象(楚穎論文)再加幾個圖(仿常申之paper)希望Int. J. Cancer這一篇被接受後,能夠把Rta對GI的contribution由我們Taiwan人自己發表(餘略)
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三個成見(二不一會):
1. Rta's function in the cytoplasm is NOT considered here.
2. Rta-mediated MN formation in cells during EBV lytic replication may NOT contribute to NPC tumorigenesis, because cells may die before MN are formed.
3. Rta does lead to MN and rH2AX formations in EBV-ve cells.
Rta, AKT/ERK and G2/M:
(1)歆蘭,勝彥,楚穎以及現在旻潔都提到Rta對M phase的加速離開有貢獻.但是SFL詳讀楚穎論文圖七,八,九後覺得是否有可能表現Rta之細胞要進入M期受阻,所以在施以thymidine或nocodazole這類同步化步驟時,M期細胞總數就較control組少(鐵證:圖九(B)中有Rta的細胞在0點時, CCNB/CDK1/AuroraB等M期蛋白均較solvent control組少),導致解除同步化後M phase加速離開的假象.
(2)同理,會不會ERK1/2在某個時間應是被shut-down的(如圖七(B)solvent control r6, r8),但是有Rta時這個checkpoint的到達非常不容易,因此有Rta表現的細胞ERK1/2都是on著的,所以總量以western blot analysis分析時就較control組高.
要釐清這二點的話,應該:
(1)請再提醒我一下除了看M期各蛋白提前消失外,還用什麼方式證明Rta對M phase的加速離開有貢獻.
(2)現在旻潔double thymidine block的實驗中(陳老師說已非常完美),能否以flow驗證一下圖七(B)下面那個表格的實驗,看看release後每個週期的細胞群比例.
再來是讀完paper和聽到大家的實驗結果後的感覺與猜測:
(1) 當Dox一加,Rta被誘導出來後,p21/p27等等regulator跟著就被誘發出來/抑制下來(在transcriptional level).細胞受到這些"cue"所產生的表象就是緩緩地進行細胞週期:其中一些被迫停在G1,這些細胞S phase所須的材料都沒有準備好,因此無法繼續前進.能夠前進的則進入S phase,開始做DNA replication的工作,做完後進入G2,準備M期所需材料.之後依前類推凡是能突破checkpoint的就往下,不能的就等待.所以若能將細胞同步化在某一點,release後以flow分析,有Rta的那一組,每個細胞週期的細胞數比例會與對照組不同,而這時候依照cell cycle變化,就可以說明Rta在HEp2中雖然無法讓細胞停住不再分裂,但是因為Rta及其衍生物擾亂了每一步驟的進行,而使生長曲線變慢.
(2)可能是細胞的不同,293TetER是明顯地被停在G1 phase,但是HEp2TetER則是doubling time由24變51小時.這裡我的一個疑問就是:在這由1X變為2x的51小時當中,究竟是大部分有Rta的細胞都放慢腳步在複製,還是這個 population中有部份細胞Rta掉了,所增加的細胞數其實是來自這部份的貢獻.有沒有辦法區分這兩者?有用IFA做過Flag-ER在 HEp2TetER/Dox的陽性率嗎?另外一點隱憂就是,當我們在passage細胞時,其實許多cell surface molecules會傳遞訊號進入細胞內.所以對一些已被Rta及其轉活化產物作用到某一程度的cell,當你以"盤子滿了,得passage!"的步驟 處理後,細胞肯定又加入許多signals,說不定reset所有之前Rta及其轉活化產物所累積的"功德".這一點要想一下怎樣control或是證明 沒有effect.
(3)Akt/ERK1/2的持續活化應該是來自於Rta/Rta轉活化產物的共同效應(you can not agree with me more, right?).這些點找出來paper就有了,Rta促進MN產生就有機制了,晚上睡覺時就不會覺得好像哪裡不對勁..相反的不管這些點硬要說Rta在細胞質裡somehow activates ERK1/2, AKT,p38,JNK...或是Rta表現somehow促進MN產生而造成NPC GI,這些都有點偷岬步令我無法信服(I can not agree with them anymore).
(4)According to陳老師,這些data最好是速速整理成論文發出去,被PRC搶先發表他會很難過的.通訊作者是許老師,第一作者未定.我個人頃向由勝彥,楚穎,旻潔協調出一人來.主要菜色建議這樣端出來:
Title:EBV Rta induces MN formation in HEp2 cells.
(Figure 1):Rta increases the doubling time of HEp2TetER from 24 h to 51 h by delaying the progression of cell cycle in G1,xx and yy, while promoting the exit of M phase (真的嗎?).
(Figure 2):Constitutive activation of AKT, ERK1/2, and xx signaling proteins are observed in Rta-expressing HEp2 cells.
(Figure 3):MN formation is dramatically enhanced in HEp2 expressing Rta (全上囉,圖啊,表啊of bi-nucleated, multi-nucleated, mis-segregated,以及日後的karyotyping)
(Figure 4):Rta-associated MN is mediated by ERK1/2 signaling pathway (U0126)
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of M phase pre-exit(論文圖八圖九), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of p21's interference in G2/M(楚穎的救命寶), or,
(Figure 5):Rta-associated MN is a result of constitute activation of ERK1/2(by DUSP3 or BRAP2最好不要是這個), or,
Figure 5 and more:newer results and corrections from 各位!
加油了,米那桑,把走過的留下一點痕跡吧!
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