6/22 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收細胞計數螢光比例(第4次實驗)。發現綠螢光的細胞佔全部細胞約80-85%；紅螢光的細胞佔綠螢光細胞約30%(Dox)、5-10%(NC)、30%(shLuc)、40-50%(shOGT-A1)及65-70%(shMGEA5-B2)。收lysates進行WB確認。且用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 進行Q-PCR檢查送入shOGT的293FT細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，反之亦然。由於結果無法排除off-target作用，進行或重複實驗以確認。
(3) TW01TetLuc有2株clones及TW05TetLuc有8株clones進行IFA (Flag Ab) 確認。由於背景值太高，無法確定是否有Luc蛋白質表現，故進行WB以確認。

ChIP-Seq皇后網站

Dan介紹的ChIP-Seq皇后網站。 參考一下她的Protocol專區。

0615 Lab meeting-蔡小丸

1. 再次整理Pin1對於K-RTA的影響, 結果顯示Pin1會結合至K-RTA 並且影響K-RTA之穩定性, 而Pin1結合至K-RTA是經由其WW domain, 且isomerase activity也貢獻於pin1與K-RTA之交互作用
2. 此外, S634A/S636A被anti-MPM2結合的能力較差, 表示S634/S636可能是Pin1所結合的位點
3. Pin1對於K-RTA活性的影響 則尚未釐清
4. 完成oral cancer tissue array (OR2081)的DDR1染色

06/08 Lab Meeting- 小夏

1. The long-term kinetics (0-6 days) of Rta in Dox-treated TW01TetER
2. The cytotoxicity of U0126, Rapamycin and LY294002 on TW01TetER
3. Effect of serum starvation on the cell morphology, cell number and cellular hypertrophy

TW01TetER相關

(AC503, Ingrid, 2010-05-18) 6-well plate format (200K/well = 100K/ml)(1) No Dox control of both cells grew similarly before Day4, doubling time約為24h
(2) #7 continued to grow between Day 4 and Day 7
(3) #19 stopped to increase after Day 4 (猜測是第三天換 medium時同時移掉 死細胞)
(4) YLC 將Day 8細胞拿來做SA-b-Gal staining,是positive, 但比例不詳

(AC 263 小夏) 6-well plate format (200K/well = 100K/ml) DNA content analysis @ 48 h
Results: 71% vs. 78% (#7); 72% vs. 84% (#16); 72% vs. 85% (#19)

(AC 278 小夏) 6-well plate format (100K/well = 50K/ml) DNA content analysis @48 h
Results: 49% vs. 57% (#7); 56% vs. 80% (#19)
(AC401, 小嬿) 24-well plate format (10K/well = 25k/ml); 7.5% FBS, 三天補一次Dox
(1) No Dox control of both cells grew fine until Day 6 (i.e. in 24-well plate, 從10K 長到 200/300K都還OK換算為concn就是500K-750K/ml都還可以)
(2) On day 8, both #16 and #19 have dead cells

所以綜合大家的條件若細胞養在 50K/ml, 在前五天估計細胞都不會因太滿而死掉。上圖附上小嬿細心的記數圖表，是八天的結果。

考慮用Bioruptor sonicate你的protein extract

上週末Bioruptor業務幫我們把儀器fix好的同時，也提及許多Lab在置備protein extract的同時，現在都會加一步sonication的步驟。

set at "Low", 5 cycles.

據說這樣才可以充分地把胞膜上面的蛋白質都萃取出來。有做膜蛋白的人要注意一下! 非膜蛋白的人也可以試試看多加這一步驟，protein是不是萃取得更完全。

06/01 Lab Meeting-小嬿

1. 設計12個target gene的CTCF binding site primers. 初步用ERKV及Raji的genomic DNA測試primer, 九組較佳, 三組較弱, 一組沒有p出來. -->後面這四組primer會再做進一步確認condition
2. 利用IP觀察CTCF是否跟Rta有interaction. IP CTCF後有抓到Rta, 但其抓到的量與Dox induction與否沒有關係(偽Rta?). (使用ICON的blocking reagent後, IgG的band有比較乾淨.)
3. 利用Thermo的fraction kit區分TW01TetER-19細胞的cytosol及nuclear protein. PARP1及CTCF乾淨地位於核內; Rta, p53, H3在cytosol有殘留; GAPDH及a-tubulin主要在質; 怪的是PCNA大部分在細胞質.

-->1. 這篇paper指出位於質內的PCNA具有anti-apoptosis的效用(in neutrophil), 或許這是TW01細胞可以serum starvation還如此快樂的原因之一. (而一點點的PCNA在核內就夠DNA replication 用?或大部分細胞在G1 phase, PCNA不用進核工作)
-->2. 試試沛文的fractionation方法
-->3. 試試IP Flag, 看CTCF是否會被抓下來

5/25 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (6x10^5/2ml/well/6well*6) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，發現shOGT-A1及shMGEA5-B2皆比shLuc引起更多的lytic reactivation。且送入shOGT的細胞樣本中，除了OGT蛋白質減少，MGEA5蛋白質也減少，送入shMGEA5的細胞樣本中，除了MGEA5蛋白質減少，OGT蛋白質也減少。重複之前收集的2次實驗樣本，也得到一樣的結果。進行Q-PCR檢查送入shOGT的細胞樣本中，MGEA5的mRNA是否有減少，避免shRNA有認錯目標的效用。且用IP將KR抓下，用WB來確認O-GlcNAc變化程度。
(2) 將TW05TetER的＃7+9+10+12 (Flag Positive ratio=87~-96％) pool成一個clone。
(3) 重新建立TW01TetLuc及TW05TetLuc，目前正在用Zeocin篩選clones。
(4) TW05TetER/gZ有28clones進行WB篩選，Rta alone、gZ alone和Rta+gZ皆有篩出，接下來進行IFA確認。

05/18 Lab meeting-蔡小丸

1. 利用黃老師家學姊提供之unknown cancer tissue sample進行DDR1之IHC練習
2. 試著釐清Pin1對於K-RTA蛋白質穩定性的角色及對於K-RTA transactivation ability的影響
~~但結論仍在一片渾沌中~~
3. DNCDK9對於K-RTA transactivation ability有抑制的效果 但仍不能排除 DNCDK9是全面性抑制了transcription

05/11 Lab Meeting- 小夏

報告：
1. The expression kinetics (0-72 h) of cell cycle regulators and viral immediate-early proteins in Dox-treated TW01EREV-2716. (Rta, EAD, p53, SFN)
2. The cytotoxicity of U0126 on TW01EREV-2716: 72hr, IC50=45.76uM
3. Pretreat 20uM U0126 1hr before dox treatment can inhibit activation of MAPK (ERK 1/2), but don’t inhibit EBV reaction in 2716.
討論：
首先先釐清
1. Cell density與cell growth/senescence/death以及 viral reactivation有關
2. Dox conc.還可以降低嗎?
3. TW01TetER senescence的程度? (#16待做….)
3. 將以前做Rapa的實驗找出來看，綠染似乎有較淡，細胞數似乎有多一些，可以看看Rapamycin, LY其他抑制劑也許在Cell background不同的TW01上會有效。
4. 將MB教授的文章好好讀一讀。

05/03 Lab Meeting-小嬿

1. 比較Dox- 和TPA/NaB-treated TW01-EREV-26(ER-high)/2716(ER-medium):
a. the amount of spontaneous lytic and the responses to inducers: 2716 > 26
b. Dox在2716的反應比TS佳, 但在26的反應比TS差
c. 未比較protein expression level
2. 比較Dox-treated TW01-EREV-26/2716(0-6天):
a. viral proteins: Flag-Rta/total Rta與之前結果相同: 26>2716; BZLF1, BMRF, BLLF1在兩細胞株都以類似EREV8的cascade pattern出現, 但表現量2716>26; latent protein, EBNA1在Dox處理後也有稍稍增多的現象, 2716較為明顯
b. viral particles: 24小時未有病毒量的變化, 48小時開始induce出病毒, 26細胞株所產病毒量約在5-10x 10^4/ml, 而2716的72小時約為10^6/ml, 72-144小時的病毒量相差不大
c. cell death associated markers: 目前試了caspase-3及PARP-1. caspase-3的cleavage form在26較多, 但在induce 3天之後便減少(in both cells); PARP-1的pattern類似於caspase-3.
d. cell cycle associated proteins: (G1) CDK4/6, CCND1, CCND3下降; p21, p27, p53, SFN上升; CCNE1變化不明顯; (S) CCNA, E2F1, p-pRb, pRb下降

Future work:
1. 釐清cell death與viral reactivation之間的順序 (by TUNEL assay?)
2. 除了apoptosis之外, 可觀察其他如autophagy相關markers

4/27 Lab Meeting-ingrid

(1) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質的確有減少，A1效果比D1好。shLuc的lysates中，OGT的表現隨著時間增加而增加(?)(但Tubulin也隨之增加?)。

(2) 以shLuc、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，48小時後加Dox，再48小時收lysates進行WB確認，因結果難以得出結論，故重新hybridize with OGT Ab。

(3)以shLuc、shMGEA5、shOGT的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24小時後加Dox，再72小時收lysates進行WB確認，似乎引起的lytic reactivation沒有差異或看不出關聯性(與之前做的結果不一樣)。