報告進度
(1) TW03Tet：因挑選細胞株TetR表現差，故重新挑選。
TW05Tet：以#4進行接下來的穩定細胞株篩選 (#3、#4及#6送入液態氮)，包括Flag-Luc、Flag-gZ+Rta(1：3)、Flag-Rta
(2)以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus (稀釋倍數1/8) 送入ERKV (2.4x10^5/ml/well/12well) 中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
(3)以SK-N-SH cell lysates當作OGT Ab的positive control，同時確認goat二抗是否可用。
Jan 27, 2011
01/26 Meeting 小嬿
Progress Report:
1. The stability of EBV Rta
a. the expression level of RTS-15 and Flag-Rta is similar but slightly higher than Rta-V5.
b. Rta expression level of 6-hr transfection is blocked by MG115 and fragmented into smaller size, and the fragments are stablized by MG115 treatment.
2. The expression level of Akata-EGFP/EBV and Akata-p2089 is similar.
3. Higher titer of viral particles were detected in long-term induction of Akata-EGFP/EBV but the infectivities were decreased.
4. Profiling of TW01-EREV-27
-Induction rate is correlated to cell density. Lower is better.
-to be continued.
1. The stability of EBV Rta
a. the expression level of RTS-15 and Flag-Rta is similar but slightly higher than Rta-V5.
b. Rta expression level of 6-hr transfection is blocked by MG115 and fragmented into smaller size, and the fragments are stablized by MG115 treatment.
2. The expression level of Akata-EGFP/EBV and Akata-p2089 is similar.
3. Higher titer of viral particles were detected in long-term induction of Akata-EGFP/EBV but the infectivities were decreased.
4. Profiling of TW01-EREV-27
-Induction rate is correlated to cell density. Lower is better.
-to be continued.
Jan 20, 2011
0119 Lab Meeting-蔡小丸
報告進度:
1. 利用外送PCDNA3-Flag CDK9, PCMV-Flag2-DN-CDK9及PIRES-hrGFP-cyclin T1進行K-RTA的in vitro kinase assay, 初步看到KRTA被CDK9磷酸化,而DN-CDK9則不具有這樣的能力
2. silence DDR1後對於oral cancer cells生長曲線的影響
希望快快將data補起來!! 加油!!
1. 利用外送PCDNA3-Flag CDK9, PCMV-Flag2-DN-CDK9及PIRES-hrGFP-cyclin T1進行K-RTA的in vitro kinase assay, 初步看到KRTA被CDK9磷酸化,而DN-CDK9則不具有這樣的能力
2. silence DDR1後對於oral cancer cells生長曲線的影響
希望快快將data補起來!! 加油!!
Jan 19, 2011
Jan 18, 2011
01/12 Lab Meeting-蔡小丸
報告英國Sahai先生兩篇collective cell migration的paper。2007年這篇是他們建立3D culture system研究squamous cell carcinoma (SCC)的collective invasion，他們發現，cancer associated fibroblast具有帶領一整群SCC invasion的能力。而cancer associated fibroblast會造成matrix remodeling及”track”的形成，以幫助SCC invasion，而這是經由integrin a3、a5、Rho-ROCK路徑。
2011這篇延續2007年的發現，進一步詳盡探討SCC的collective invasion，他們發現要發生collective invasion時，cancer cell的actomyosin (包含F-actin, phospho-MLC及MyosinⅡa)會reorganization。他們觀察到癌細胞與細胞間的actomyosin的活性都是明顯下降的，並進一步發現DDR1會參與actomyosin活性的調控，而DDR1調控collective invasion與它已知的ligand ”collagen”及它的kinase activity沒有太大的關聯性。利用GST-pull down發現DDR1會與Par3及Par6的PDZ domain形成complex，並進一步影響RhoE的分佈，而影響ROCK driven的actomyosin活性，因此，一但阻斷DDR1/Par3/Par6，SCC的collective invasion則會被中斷。本篇提供了DDR1/Par3/Par6在SCC的collective invasion時可能扮演的角色。
2011這篇延續2007年的發現，進一步詳盡探討SCC的collective invasion，他們發現要發生collective invasion時，cancer cell的actomyosin (包含F-actin, phospho-MLC及MyosinⅡa)會reorganization。他們觀察到癌細胞與細胞間的actomyosin的活性都是明顯下降的，並進一步發現DDR1會參與actomyosin活性的調控，而DDR1調控collective invasion與它已知的ligand ”collagen”及它的kinase activity沒有太大的關聯性。利用GST-pull down發現DDR1會與Par3及Par6的PDZ domain形成complex，並進一步影響RhoE的分佈，而影響ROCK driven的actomyosin活性，因此，一但阻斷DDR1/Par3/Par6，SCC的collective invasion則會被中斷。本篇提供了DDR1/Par3/Par6在SCC的collective invasion時可能扮演的角色。
Jan 12, 2011
01/12 Lab Meeting-小嬿
報告進度:
1. 偵測Dox-treated TW01-EREV-26/27的
a. viral particles, 似乎隨時間增加, 但infectivity待測
b. viral protein expression pattern比EREV8稍快
c. 27的viral particles production比26高
d. 此次的NaB效果遠比Dox低, 可多試NA或EREV8當positive control, 確定NaB效果
e. 細胞數少的induction efficiency較好
2. ChIP的sonication條件:
fixation mode: suspension
cell conc: 1.5 x 10^7 cells/ml,
sonication vol: 150 ul/reaction
sonication cycle: 30" ON, 30" OFF, for 10 cycles
3. RTS-15與Flag-Rta送入293細胞後的表達量相當, 但加MG115之後未stablize Rta的量
1. 偵測Dox-treated TW01-EREV-26/27的
a. viral particles, 似乎隨時間增加, 但infectivity待測
b. viral protein expression pattern比EREV8稍快
c. 27的viral particles production比26高
d. 此次的NaB效果遠比Dox低, 可多試NA或EREV8當positive control, 確定NaB效果
e. 細胞數少的induction efficiency較好
2. ChIP的sonication條件:
fixation mode: suspension
cell conc: 1.5 x 10^7 cells/ml,
sonication vol: 150 ul/reaction
sonication cycle: 30" ON, 30" OFF, for 10 cycles
3. RTS-15與Flag-Rta送入293細胞後的表達量相當, 但加MG115之後未stablize Rta的量
Dec 30, 2010
12/29 Lab Meeting-ingrid
報告進度
(1) TW03Tet有10株細胞株，TW05Tet有8株細胞株，已凍管且收好cell lysates等待Western analysis確認。
(2) 目前要進行的實驗如下
a. 將不同稀釋倍數(0、1、1/2、1/4、1/8、1/16)的pAS-EGFP lentivirus送入293中，48小時後，計數細胞存活及死亡比率，同時跑FLOW。(這次infection時，不從細胞上移除含有polybrene的medium)
b. 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus送入ERKV中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
c. 將OGT Ab的條件抓好。
(1) TW03Tet有10株細胞株，TW05Tet有8株細胞株，已凍管且收好cell lysates等待Western analysis確認。
(2) 目前要進行的實驗如下
a. 將不同稀釋倍數(0、1、1/2、1/4、1/8、1/16)的pAS-EGFP lentivirus送入293中，48小時後，計數細胞存活及死亡比率，同時跑FLOW。(這次infection時，不從細胞上移除含有polybrene的medium)
b. 以shLuc、shOGT、shMGEA5的lentivirus送入ERKV中，24、48、72小時後，收lysates進行WB確認目標蛋白質是否有減少。
c. 將OGT Ab的條件抓好。
Dec 27, 2010
12/22 Lab Meeting-ingrid
報告Hart新作：
(1) 以chemoenzymatic assay及抗體確認histone有O-GlcNAcylation
(2) 以LC MS/MS定義出histone上有被O-GlcNAc修飾的位點：Ser47 of H4、Ser36 of H2B和Thr101 of H2A
(3) Heat shock(45℃，1hr)及後續的recovery的時候，發現histone的O-GlcNAc程度逐漸提升，同時OGT活性也有緩慢上升
(4) 以MNase chromatin-sensitivity assays檢測發現Heat shock及後續的recovery時候，Chromatin(染色質)會condense
(5) 過量表現OGT會比過量表現GFP的細胞的染色質更加condense
(1) 以chemoenzymatic assay及抗體確認histone有O-GlcNAcylation
(2) 以LC MS/MS定義出histone上有被O-GlcNAc修飾的位點：Ser47 of H4、Ser36 of H2B和Thr101 of H2A
(3) Heat shock(45℃，1hr)及後續的recovery的時候，發現histone的O-GlcNAc程度逐漸提升，同時OGT活性也有緩慢上升
(4) 以MNase chromatin-sensitivity assays檢測發現Heat shock及後續的recovery時候，Chromatin(染色質)會condense
(5) 過量表現OGT會比過量表現GFP的細胞的染色質更加condense
12/22 Lab Meeting-蔡小丸
1. 成功移除OEC-M1內的mycoplasma
2. 比較多株口腔癌細胞DDR1 autophosphorylation的情形 初步結果顯示台灣地區口腔癌細胞株的DDR1 tyrosine phosphorylation的程度較高
3. 一系列K-RTA vs. CDK1,2,6,9的in vitro kinase assay 仍須再試條件 讓結果更明顯 希望會成功!!!
2. 比較多株口腔癌細胞DDR1 autophosphorylation的情形 初步結果顯示台灣地區口腔癌細胞株的DDR1 tyrosine phosphorylation的程度較高
3. 一系列K-RTA vs. CDK1,2,6,9的in vitro kinase assay 仍須再試條件 讓結果更明顯 希望會成功!!!
Dec 21, 2010
12/15 Lab Meeting-小嬿
報告進度:
1. TW01EREV_S無法用SAHA induction成功-->放棄S
2. 所建立的Akata-p2089, 用hIgG沒有辦法induction(by Q-PCR), 在induce 96hrs情況下, 看不到Rta, Zta及EAD表現, 但有少量的gp350/220. 根據之前研究, 可續偵測LMP2A的存在與否.
3. Akata-EGFP/EBV在hIgG induce 48hrs可到達plateau (in sup, by Q-PCR).
4. 目前所建立的35個TW01EREV中, EBV Rta表達量高者似乎無法induction, 僅有TW01EREV-26可用NaB產出較高量的病毒; 在EBV Rta表達中量者中, 挑到1個Dox與 NaB效果相當-TW01EREV-27. 但其induction rate, viral particles等細項仍須confirm.
5. 搜尋其他研究者的ChIP sonication 條件.
1. TW01EREV_S無法用SAHA induction成功-->放棄S
2. 所建立的Akata-p2089, 用hIgG沒有辦法induction(by Q-PCR), 在induce 96hrs情況下, 看不到Rta, Zta及EAD表現, 但有少量的gp350/220. 根據之前研究, 可續偵測LMP2A的存在與否.
3. Akata-EGFP/EBV在hIgG induce 48hrs可到達plateau (in sup, by Q-PCR).
4. 目前所建立的35個TW01EREV中, EBV Rta表達量高者似乎無法induction, 僅有TW01EREV-26可用NaB產出較高量的病毒; 在EBV Rta表達中量者中, 挑到1個Dox與 NaB效果相當-TW01EREV-27. 但其induction rate, viral particles等細項仍須confirm.
5. 搜尋其他研究者的ChIP sonication 條件.
Nov 24, 2010
11/24 Lab Meeting-蔡小丸
1. 除了OEC-M1以外 其他的口腔癌細胞株都沒有mycoplasma的污染
2. 多株口腔癌細胞株DDR1表達量之比較
3. shDDR1及Glivec對於非台灣地區 口腔癌細胞的影響
4. 持續測試OSCCs之DDR1 activity (phospho-Tyrosine status)
2. 多株口腔癌細胞株DDR1表達量之比較
3. shDDR1及Glivec對於非台灣地區 口腔癌細胞的影響
4. 持續測試OSCCs之DDR1 activity (phospho-Tyrosine status)
Nov 20, 2010
Subscribe to:
Posts (Atom)