進度報告:
1. 確定ChIP的前置步驟條件:
Cell: 4 x 10^7 cells/ml lysis buffer
Sonication: 45" ON, 45" OFF for 10-12 cycles (depend on cell type)
2. 在TW01-EREV_2716細胞中, 觀察到CTCF在Dox處理24小時後結合在cellular promoters上的量比6hrs與未處理Dox的細胞來得多. 顯示 Rta的出現可能讓CTCF對這些promoter的affinity更好. 但是在EREV8細胞中, 同樣的時間點沒辦法看到類似的情況.
--> 補齊其他cellular promoter的PCR detection.
--> 目前推測TW01EREV-2716走lytic cycle的速度比EREV8來得快, 可能24hr還看不到CTCF在EREV8細胞的變化. 試試在EREV8細胞中觀察48小時的CTCF ChIP.
Nov 24, 2011
Nov 22, 2011
11/09 Lab Meeting-ingrid
1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。
2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
Nov 2, 2011
2011026 Lab meeting-蔡小丸
1. 測試anti-DDR1 (Sanat Cruz, C-20) IP條件, 發現增加Ab的量, 並沒有增加IP下來DDR1的量
2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件
3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑
2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件
3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑
Oct 30, 2011
2011-2012 Rehearsal, Site Visit, and Retreat
2011/10/6–7 Rehearsal
2011/10/29–30 Scientific Review/Site Visit
2012/2/17–18 PI Retreat
Review Member:
鄭院士、龔院士、楊院士、劉院士、閻校長、洪院士、院長、王副院長
PI 23 RA/postdoc 20
Director Chang JY
Drug discoverypast 3-yr publication
HuR bind to HIF1a mRNA stablization (inhibited by MPT0B098)
MPT0B098 decreased cytoplams translocation of HuR
MPT0B292 HDAC6 inhibitor
HDAC6 acetylates a-tubulin
Ca2+ influx STIMI Ac actin
What is the effect of actin acetylation upon STIM1 activation?
nticancer efficacy of PLGA-30
MGMT modulates therapeutic efficacy of platinum drugs with radiation and its clinical significance
2012-02 補遺:
2011/10/29–30 Scientific Review/Site Visit
2012/2/17–18 PI Retreat
Review Member:
鄭院士、龔院士、楊院士、劉院士、閻校長、洪院士、院長、王副院長
PI 23 RA/postdoc 20
Director Chang JY
Drug discoverypast 3-yr publication
HuR bind to HIF1a mRNA stablization (inhibited by MPT0B098)
MPT0B098 decreased cytoplams translocation of HuR
MPT0B292 HDAC6 inhibitor
HDAC6 acetylates a-tubulin
Ca2+ influx STIMI Ac actin
What is the effect of actin acetylation upon STIM1 activation?
nticancer efficacy of PLGA-30
MGMT modulates therapeutic efficacy of platinum drugs with radiation and its clinical significance
2012-02 補遺:
- Cheng Gung 70–80% OrCa patients have betel quid habit, radiotherapy is okay; chemotherapy (cisplatin + EGFR inhibitor or taxol)
- Auro Kinae Inhibitor (a multi-target kinase at 100 nM range)
Oct 17, 2011
10/12 Lab Meeting- 小夏
1. TW05TetER的doubling time為22.5hr，與TW05TetLuc差不多，繼續持續觀察。將計數long-time treatment的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity。
2. 設計TW05TetER做 "escape" 的實驗。
3. The expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
a. 在12-96hrs之間看不出kinetics，首先將找出Flag抗體的最佳條件，將Flag-ER壓出。
b. Dox induce 24hr之後wash off之後看12hr至72hr protein的degradation，結果Rta確實隨著時間degradate，但預設應該沒有變化的Luc72hr 卻也detect不到任何訊號，猜測也許是沒有加到dox(?)，將另一批sample lysis來確認這件事情。
4. Establishment of TW05EREV
目前有9株clones，1號細胞株先以Dox或TS induce 48hr以IFA看viral protein的分布比例; 及Q-PCR來偵測viral partical。IFA結果 Flag-Rta每一顆細胞都有，Q-PCR結果viral partical 偵測不到。未來screen clones看induction time 為72hr之後，先以Q-PCR來看viral partical是否有出來為主。
2. 設計TW05TetER做 "escape" 的實驗。
3. The expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
a. 在12-96hrs之間看不出kinetics，首先將找出Flag抗體的最佳條件，將Flag-ER壓出。
b. Dox induce 24hr之後wash off之後看12hr至72hr protein的degradation，結果Rta確實隨著時間degradate，但預設應該沒有變化的Luc72hr 卻也detect不到任何訊號，猜測也許是沒有加到dox(?)，將另一批sample lysis來確認這件事情。
4. Establishment of TW05EREV
目前有9株clones，1號細胞株先以Dox或TS induce 48hr以IFA看viral protein的分布比例; 及Q-PCR來偵測viral partical。IFA結果 Flag-Rta每一顆細胞都有，Q-PCR結果viral partical 偵測不到。未來screen clones看induction time 為72hr之後，先以Q-PCR來看viral partical是否有出來為主。
Sep 28, 2011
09/28 Lab Meeting-小嬿
學姐, 教師節快樂!!
進度報告:
1. 利用Chromatin IP的sample做IP-WB測試CTCF/Flag/Rta抗體使用量:
(1) CTCF使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳
(2) Flag使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳, 但抗體未完全bind在磁珠上, 可再降低抗體量
(3) Rta抗體(Argene)黏附於磁珠的效果不佳, 所抓到的Rta量也不多
--> 確定sonication條件之後就可以上述兩個較好的抗體做ChIP!
2. 測試Akata-EGFP/EBV產出的病毒infect HEK293細胞的效率
(1) 以IgG-48hrs的效果最好, 但所看到GFP(+)的細胞大部分都不健康-->調整病毒濃縮的倍數, 看看是不是病毒太多, 或PEG太多讓細胞有毒性
(2) 將infect 48hrs的細胞收下測得微弱的Rta跟size較小的Zta--> Z若未經modification應為29kDa, 用western看到Akata strain的Z約38kDa, 比B95.8大(約36kDa); 而truncated form最小, 約31kDa(推算); 之後可收RNA, 看所測到的Z是否有truncation.
進度報告:
1. 利用Chromatin IP的sample做IP-WB測試CTCF/Flag/Rta抗體使用量:
(1) CTCF使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳
(2) Flag使用cell signaling的rabbit Ab(12 ul)效果較佳, 但抗體未完全bind在磁珠上, 可再降低抗體量
(3) Rta抗體(Argene)黏附於磁珠的效果不佳, 所抓到的Rta量也不多
--> 確定sonication條件之後就可以上述兩個較好的抗體做ChIP!
2. 測試Akata-EGFP/EBV產出的病毒infect HEK293細胞的效率
(1) 以IgG-48hrs的效果最好, 但所看到GFP(+)的細胞大部分都不健康-->調整病毒濃縮的倍數, 看看是不是病毒太多, 或PEG太多讓細胞有毒性
(2) 將infect 48hrs的細胞收下測得微弱的Rta跟size較小的Zta--> Z若未經modification應為29kDa, 用western看到Akata strain的Z約38kDa, 比B95.8大(約36kDa); 而truncated form最小, 約31kDa(推算); 之後可收RNA, 看所測到的Z是否有truncation.
Sep 23, 2011
9/21 Lab Meeting-ingrid
報告Thorley-Lawson DA.在上個月的PLoS Pathogens發表的paper
A Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia.
作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。
A Novel Persistence Associated EBV miRNA Expression Profile Is Disrupted in Neoplasia.
作者利用primary normal infectious tissues : LCL, NCB, MemB及tumor biopsies : HD, NPC, GaCa, BL進行34種EBV miRNA分析。將12種BART miRNAs命名為latency III associated miRNAs。而這些miRNA在分類為latency I (BL) 及latency II (HD, NPC, GaCa) 腫瘤組織中皆失去控制而表現量增加；相對於另一群EBV miRNAs，則BHRF1 miRNAs (大部分皆表現在latency III的LCL) 則並未失去控制而表現量很低。接著以heat-map/clustering或principal component analysis進行資料分析，發現並沒有tumor-specific miRNA，但综合所有數據，的確可以將不同腫瘤分類，類似於電腦界及物理界的”secret sharing”定律，舉例說明，在約40種miRNAs中，任選5個miRNA就足以將腫瘤分類成功的機率約為60%。最後以細胞株進行分析，發現若以研究miRNA而言，這些腫瘤細胞的表現形式已與他們的來源腫瘤組織不同。
Sep 16, 2011
兩篇有趣的文獻: from Mol Marker Lab
Sep 14, 2011
0914 Lab meeting-蔡小丸
1. 著手進行三張tissue microarray的DDR1 staining給分
(1) 依顏色深淺給予: 0-3分
(2) 依tumor所佔區域大小給分: 0-3分
(3) 分部位分開計分 (已完成舌頭, 臉頰)
仍需解決的問題是 tumor part的判別~~需要請教別人 並且再多看一些slide 累積經驗
希望早日完成計分 並進行統計分析
2. 學姊建議整理DDR1相關data, 以利之後的方向
(1) 依顏色深淺給予: 0-3分
(2) 依tumor所佔區域大小給分: 0-3分
(3) 分部位分開計分 (已完成舌頭, 臉頰)
仍需解決的問題是 tumor part的判別~~需要請教別人 並且再多看一些slide 累積經驗
希望早日完成計分 並進行統計分析
2. 學姊建議整理DDR1相關data, 以利之後的方向
Sep 12, 2011
09/07 Lab Meeting- 小夏
A. Whether serum is required for Rta-induced senescent phenotype in TW05tetER
1. 找出positive control沒有出來的原因。
2. 在一直serum free的情況下，dox-induction若有差別，才可以說明serum的重要性。
3. SA-beta-gal stain在9天有部分細胞是negative，像Escapee的細胞，也許時間要抓早一點來減少這些細胞的比率。
B. 接著先完成以下:
To figure out the expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
TW05TetER的doubling time，生長曲線。
1. 找出positive control沒有出來的原因。
2. 在一直serum free的情況下，dox-induction若有差別，才可以說明serum的重要性。
3. SA-beta-gal stain在9天有部分細胞是negative，像Escapee的細胞，也許時間要抓早一點來減少這些細胞的比率。
B. 接著先完成以下:
To figure out the expression kinetics and stability of EBV Rta inTW05Tet cells
TW05TetER的doubling time，生長曲線。
Aug 31, 2011
08/31 Lab meeing-小嬿
1. to observe whether CTCF interact with EBV Rta by Immunoprecipitation assay
a) in TW01 inducible cell lines, CTCF and Flag-Rta can not be immunoprecipitated by each other. I also tried Flag beads, which are provided by Sigma, both of Flag-Luc and Flag-ER caught CTCF. I can not prove the interaction between CTCF and EBV Rta in TW01 inducible cell lines.
b) in co-transfected HEK293/293FT cell lines(Flag-Luc/ER/KR), CTCF can immunoprecipitate Flag-ER. However, the ratio of each plasmid is unfair, i will adjust the amount of these plasmids (may ignore Luc) and perform this experiment again.
2. to screen 12 putative target genes in CTCF/Flag-ChIP samples
利用Q-PCR的方式, 這12個genes無法在CTCF-ChIP的samples中被偵測到; 但利用一般PCR的方式, 則可偵測到JUN及H19(雖然band很微弱)
a) 在ChIP之前的sonication片段可能太短, 以至於所設計的這些將近500 bp PCR product的primer不能bind上DNA
b) ChIP的效率不好, 在抗體/磁珠/sample量的比例上該做些調整
a) in TW01 inducible cell lines, CTCF and Flag-Rta can not be immunoprecipitated by each other. I also tried Flag beads, which are provided by Sigma, both of Flag-Luc and Flag-ER caught CTCF. I can not prove the interaction between CTCF and EBV Rta in TW01 inducible cell lines.
b) in co-transfected HEK293/293FT cell lines(Flag-Luc/ER/KR), CTCF can immunoprecipitate Flag-ER. However, the ratio of each plasmid is unfair, i will adjust the amount of these plasmids (may ignore Luc) and perform this experiment again.
2. to screen 12 putative target genes in CTCF/Flag-ChIP samples
利用Q-PCR的方式, 這12個genes無法在CTCF-ChIP的samples中被偵測到; 但利用一般PCR的方式, 則可偵測到JUN及H19(雖然band很微弱)
a) 在ChIP之前的sonication片段可能太短, 以至於所設計的這些將近500 bp PCR product的primer不能bind上DNA
b) ChIP的效率不好, 在抗體/磁珠/sample量的比例上該做些調整
Aug 29, 2011
8/24 Lab Meeting-ingrid
(1) 用IP將KR抓下，用WB(RL2)來確認O-GlcNAc變化程度；經更改IP流程，可以有效率以KR(660) from ICON將KR抓下(ERKV_Dox48h)，但是之後應用於ERKV_shLuc_Dox48h、ERKV_shOGTA1_Dox48h及ERKV_shMGEA5B2_Dox48h，卻效率不佳，以致於後來的RL2及PARP1皆無法辨認。目前持續改進IP流程中。Note:如果是要看KR蛋白質，建議Lysis buffer要加phosphotase inhibitor以避免KR的碎裂。
(2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(星號應水平標誌)。
(3) 經由計算細胞生長速率及考慮表現Luc蛋白質的程度，混合細胞得到TW01TetLuc pool :#2+ #8及TW05TetLuc pool:#1+ #3+ #5。
(4) 三種Flag Ab測試(Sigma F1804舊、Cell Signaling及Sigma F1804新)：認識Luc蛋白質在TW01TetLuc pool及TW05TetLuc pool的titer皆差不多，除了Cell Signaling背景比較髒。
(2) 關於進行shRNA的Q-PCR，已完成實驗數據。但是分析時，應注意星號的標誌，正確為*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(星號應水平標誌)。
(3) 經由計算細胞生長速率及考慮表現Luc蛋白質的程度，混合細胞得到TW01TetLuc pool :#2+ #8及TW05TetLuc pool:#1+ #3+ #5。
(4) 三種Flag Ab測試(Sigma F1804舊、Cell Signaling及Sigma F1804新)：認識Luc蛋白質在TW01TetLuc pool及TW05TetLuc pool的titer皆差不多，除了Cell Signaling背景比較髒。
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