關於EBV infection

關於EBV infection的實驗, 以下是我的構想, 歡迎大家提供意見討論!

目前預訂

2014/04/03 recover NP460hTert
2014/04/07 seed cells / concentrate virus
2014/04/08 infection
以上

#1由 ingrid 在 五, 04/11/2014 - 10:22 發表。

部分結果出爐

#2由 ingrid 在 一, 04/28/2014 - 16:39 發表。

Rta蛋白質在EBV感染OKB2後有表現出來喔!!

#3由 sufang 在 一, 04/28/2014 - 16:46 發表。

讚!

濁水溪的Zta抗體好嗎? 我們沒有4F10了嗎? 同理，Argene的Rta比濁水溪的Rta好嗎? 張堯老師對我們的homemade Rta抗體真是讚不絕口。

#4由 ingrid 在 一, 05/05/2014 - 14:41 發表。

重新strip後，Zta抗體(4F10)及濁水溪的Rta皆沒有band。

#5由 mmiiee 在 一, 04/28/2014 - 16:41 發表。

AC619_film

附上之前做HEK293 cells的結果與之比較(Akata EBV infected HEK293 cells for 48 hrs):

Rta和Zta的size都比預期小(預期Rta約95 kDa, Zta約36 kDa), 這張blot出現的Rta約85 kDa, Zta約32 kDa和27 kDa

#7由 mmiiee 在 四, 05/15/2014 - 21:13 發表。

抗體&時間點

NP460是不是沒希望啦, 50% positive還是測不到R/Z的話(還是來測測看EBNA1, 會不會全部都走latent去了?) 

在OKB2這組實驗裡感覺Rta要用Argene比LTK更加sensitive, Zta用4F10比LTK好. 

Zta若一樣用75 ug/lane搞不好也可以在24h偵測到. 

另外, 若用IF(免疫螢光染色)的話, 就可以區分GFP(+)到底走latent或lytic了! 

OKB2真是酷斃了!  可惜不是NP細胞 (嘆) 

#8由 EVKVLIN 在 五, 05/16/2014 - 16:04 發表。

LTK的抗體是兔子來的

所以blocking時加入BSA是不是可以減少background?

Cell Signaling或是Santa Cruz的兔子抗體，有沒有類似的建議 ?

#9由 EVKVLIN 在 五, 05/16/2014 - 15:59 發表。

若能區分 latent vs lytic infection...

那就太好了(若能區分 latent vs lytic infection)。

我們現在有幾個點要釐清:

1. NP460hTert的50%感染率要能reproducible

2. hTert, the human terlomerase, 會不會幫助EBV走latency (if so, OKF4-hTert就會和NP460hTert一樣，只能感染卻測不到Z或R, 另外，maruko看到的那個primary NP cell就很值得購買)

3. NP cell vs oral keratinocyte是不是先天就有差。想像 DA Thowerly-Lawson大師提過EBV如何在口腔部細胞長成active lytic replication的plaque。相反的, NPC這邊多是latency狀態居多。

#10由 EVKVLIN 在 四, 04/24/2014 - 16:35 發表。

來試寫一份我們家感染上皮細胞的Protocol怎麼樣?

Ingrid: 是你將功贖罪的大好時機呦!!  你可以署名 「AMO」。

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#1由 ingrid 在 三, 04/23/2014 - 09:52 發表。

我做錯了~

在seeding細胞到plate所用的培養液用錯了，本來應該是DF-K/KSFM，但只使用DF-K培養液。我想這樣解釋為什麼這麼多細胞都不貼的原因，另外也解釋丸子說種OKB2細胞隔天會有6分滿而我只有3-4分滿的原因。

還有進行cell senescence實驗時，會不會是因為只養在DF-K培養液裡面10天，而造成細胞生長停滯及SA-beta-Gal assay陽性反應的原因嗎???

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關於Day9所做的SA-beta-Gal assay

4/17星期四將細胞依照步驟固定後，放置於染色液中，因說明書要求放在37度培養箱w/o二氧化碳，所以放置於養菌培養箱過夜。

4/18星期五就是隔天來發現乾掉了!!!!!!補加新的染色液，放於37度培養箱w/二氧化碳(=細胞培養箱)。

4/20星期天就是隔二天由YLC幫忙將已被染色的細胞保存於glycerol中。 (此時幾乎100%的細胞都有染成藍色=positive)

4/21星期一將細胞拍照存檔。

PS後來發現我的說明書為新版有建議要求放在37度培養箱w/o二氧化碳，但舊版也就是YLC之前用的並無此建議(=之前SA-beta-Gal assay皆是在細胞培養箱完成)，以後應該會借用陳家的細胞培養箱w/o二氧化碳來進行實驗。

#2由 EVKVLIN 在 四, 04/24/2014 - 11:21 發表。

加錯medium的問題

(1): 那Infection時，都還是在有10%FBS的情況下吧？

(2): 可以請natsumi comment一下有沒有CO2真的會影響嗎?

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在這講求省電環保的時代裡，為了一個可能不會影響太多的assay, 特別去開一個incubator實在很不環保啊.  知道為什麼要在沒有CO2的狀態下asasy嗎? thanks.

#3由 ingrid 在 四, 04/24/2014 - 15:06 發表。

回應

那Infection時，還是在有10%FBS的情況下。(DF-K+10%FBS)

#4由 natsumi 在 四, 04/24/2014 - 11:52 發表。

回應

Sigma出的senescence kit上面有說明，如下

Note: The staining of senescent cells is pH dependent. Therefore, the cells cannot be incubated in a CO2 enriched atmosphere during the staining step. 

其實之前在細胞培養箱染也沒有什麼問題，要解決的話，就放在細菌培養箱，周邊用Parafilm封好避免乾掉就好了。

#5由 EVKVLIN 在 四, 04/24/2014 - 16:31 發表。

周邊用Parafilm封好?

那放在原來有CO2的incubator不是也可以杜絕CO2進去? 就這樣子辦吧! 大家意下如何?

#6由 sufang 在 五, 04/11/2014 - 10:29 發表。 真的假的? NP460hTert 沒有TGFb差這麼多嗎? 要不要下週再加做一組有TGFb overnight 的control (NP460hTert就好). 看看能不能重復去年的結果?

#7由 natsumi 在 五, 04/11/2014 - 13:04 發表。 AC550 根據AC550 EBV infect into TW05，有加TGFb還是有差的，尤其是在濃縮病毒情況下。 1xSup -TGFb: 5.4% ==> +TGFb: 7.6% 10xSup -TGFb: 22% ==> +TGFb: 34%

#8由 sufang 在 五, 04/11/2014 - 13:24 發表。 可是、 從來也沒有過只有1.1%這麼差呀! 難道culture medium也很有關係? drop 太多了，令人擔心...

#9由 mmiiee 在 三, 04/09/2014 - 11:14 發表。

目前想看的gene與protein

我想看的gene有: Rta, Zta, MYC, CCND1, JUN, CDK6, CTCF

protein有: Rta, Zta

還有什麼其他想看的嗎?

#10由 EVKVLIN 在 三, 04/09/2014 - 11:30 發表。 What about p21 and SFN、有p63也很不錯! 另外、妳有LANA的PCR primer嗎? 有RCR, LCR那附近的gene primer嗎? thanks.

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	#1由 mmiiee 在 三, 04/09/2014 - 13:49 發表。 手上有的... p21, SFN, EBNA1(LCR), BKRF3, BKRF4(RCR), BHLF1, BHRF1(oriLyt)都有primer 剩下p63待設計!

#2由 EVKVLIN 在 三, 04/09/2014 - 15:43 發表。 well... 那就不一定要p63.

#3由 mmiiee 在 四, 04/03/2014 - 10:45 發表。

細胞數

補充60~70% confluence細胞數:

OKB2: 2x10^5/well in 6-well plate

NP460hTert: (請YCK補充, 感恩!)

#4由 ingrid 在 四, 04/03/2014 - 16:34 發表。

細胞數

NP460hTert:  2.1~2.2 x10^5/well in 6-well plate

#5由 EVKVLIN 在 四, 04/03/2014 - 13:12 發表。

看不到下則回應的圖的人..

請使用FireFox或KKMAN瀏覽器。IE據說會出現一堆XX~Sorry.

#6由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 15:51 發表。 來po一下ingrid日前(12/11/2013)給我的整理檔案

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#7由 mmiiee 在 三, 04/02/2014 - 14:53 發表。

from Dr. Chang

紀錄一下

1. 重現之前high GFP(+) rate的實驗(穩定/確定條件)(30 % is good!)

2. 觀察GFP何時開始亮? GFP(+)細胞有無/何時分裂? 

3. control做好 (eg, UV-inactivated virus)

#8由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 15:33 發表。

應該來建議..

仲彥他們發展類似LINE的錄音檔案，講完mp3直接上傳上來! 咦，那個YouTube icon是做什麼用著?

#9由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 11:02 發表。 恭喜妳 第一篇文章將得到拿鐵一杯! (大小任挑、時間任選、品牌不拘) 想不想把 TGF-b1 那一步拿掉? 我建議加一個6 h, 去掉72 h, 然後10天改為7天。 刪除   編輯   回應

	#10由 mmiiee 在 三, 04/02/2014 - 10:52 發表。 想試試看回應要怎麼用! 想試試看回應要怎麼用!

#1由 natsumi 在 四, 04/03/2014 - 12:52 發表。

真的只有IE不可以看到圖~

as title換瀏覽器就OK了

and 個人檔案也可以自己編輯文章

#9由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 11:02 發表。

恭喜妳

第一篇文章將得到拿鐵一杯! (大小任挑、時間任選、品牌不拘)

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想不想把 TGF-b1 那一步拿掉? 我建議加一個6 h, 去掉72 h, 然後10天改為7天。

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#10由 mmiiee 在 三, 04/02/2014 - 10:52 發表。

想試試看回應要怎麼用!

想試試看回應要怎麼用!