Our Thoughts (桀靜精微雷風相薄): 2014/08/05 關於FGFR3 IHC

由 maruko 在二, 08/05/2014 - 09:34 發表

整理FGFR3已發表文章中使用Santa Cruz的anti-FGFR3(B9) 的條件及染色情形(圖片1-4)(圖片5為DDR1染在細胞核及染在細胞質)

1.後來發現原參考論文2013 J Pathol中的CC1 buffer為偏鹼的條件(PH=8) (之前疏忽了抱歉!!)

所以使用PH=6的buffer應該是較不恰當(non-specific較高) 因此會請小夏詢價買CC1 buffer再做做看應該就可知道答案了

2. 雖然大多FGFR3都染在細胞質或膜上但不能排除FGFR3 fusion可能出在核中

Start: 08/05/2014

Timezone: Asia/Taipei

Bookmark/Search this post with


	#1由 sufang 在二, 11/18/2014 - 09:38 發表。 IHC of FGFR3 in oral and bladder tissue microar http://eln.nhri.org.tw/lims/?q=node/1798 By Natsumi, published on 2014/10/9 刪除編輯回應


	#2由 natsumi 在三, 08/06/2014 - 13:58 發表。有關2013 J Pathol中的使用CC1 buffer 2013 J Pathol使用的unmasking buffer: CC1 (Tris/Borate/EDTA, pH8) 詢問結果如下: Cell Conditioning 1 (CC1) Catalog Number: 950-124 Quantity: 2 L bottle Format: Ready to Use (非10倍!!) 售價：NTD 28,000/ bottle (沒錯，沒有多一個0!!!) http://www.ventana.com/product/203?type=204 網站連結有package insert及MSDS 是撘配VENTANA做IHC機器所使用的buffer，CC1是他們偏鹼的buffer (pH8)，另外一個CC2是偏酸的buffer (pH6)。因為價格也滿昂貴的，我想不適合我們使用。這樣我們兩個選擇就是 0.1M citrate buffer, pH6 與 TEG, pH9 (10mM Tris+ 0.5mM EGTA)這兩個unmasking buffer。我也粗淺判斷了一下後面的圖，回應於下方(要到下一頁看，並且要上下頁來回對應一下了，Sorry...)。刪除編輯回應


	#3由 natsumi 在二, 08/05/2014 - 10:47 發表。加入H&E stain 的AE715 Antigen retrieval在ph9的條件下，染在的位置大部分在細胞質(如黑色箭頭所示)，而pH6的條件下，FGFR3染到的位置主要在細胞核(如紅色箭頭所示)。刪除編輯回應


	#4由 sufang 在二, 08/05/2014 - 11:25 發表。那TW2.6呢? 在pH9也有許多positive啊! 恐怕這才是non-specific staining吧! 還有，在已發表的paper中，即便是低視野，藍染部份都看得到，為什麼我們的染色大部分都是咖啡色? 刪除編輯回應


	#5由 maruko 在二, 08/05/2014 - 14:40 發表。 TW2.6沒有染到咖啡色喔 1. 我覺得 TW2.6並沒有染到咖啡色 (LiLi也是這樣說的) 2. paper中藍色的核可以看到是因為 FGFR3的咖啡色染在細胞質 3. PH6的染色看不到核的藍色是因為咖啡色都疊在它上面(所以判定他在核內) 刪除編輯回應


	#6由 sufang 在三, 08/06/2014 - 08:23 發表。回應 1. 妳的意思是說 pH9, TW2.6那些都不算是染到，但是它上面的C9就算? 可以請妳們把這個panel, C9中是的都圈起來（紅色outline), TW2.6中不是的也都圈起來(白色outline). 2. 同意。 3. 可以把你們覺得沒有染到的細胞、應該看得到藍色的細胞圈起來嗎? C9/TW2.6都好。我catch不到妳們所謂的藍色核在哪裡, 長得怎麼樣。唯有把核的顏色與形狀弄清楚再來判斷C9細胞中FGFR3-TACC3咖啡色染色情形。刪除編輯回應


	#7由 maruko 在三, 08/06/2014 - 13:49 發表。我圈出細胞核的部份還有因為染的FGFR3的顏色不深所以LiLi建議hematoxylin不要染太久否則會蓋過FGFR3的染色因此藍色很淡(這部分應該可以再調整) 細胞核我用綠色圈出來(我沒有每顆圈)(相對藍色的地方就是核) TW2.6幾乎染不到咖啡色刪除編輯回應


	#8由 maruko 在三, 08/06/2014 - 13:42 發表。說明核與質的H&E染色先利用H&E stain解釋一下細胞核跟細胞質的位置 H（hematoxylin）& E(eosin) staining，其中hematoxylin為鹼性的dye，所以會染上核(藍色)，eosin為酸性的dye 所以會染上細胞質顏色為桃紅色如下所示(綠圈圈為核) 刪除編輯回應


	#9由 maruko 在三, 08/06/2014 - 13:35 發表。我把C9 positive圈起來(紅色框) 我把C9 positive 用紅色框框圈起來如下刪除編輯回應

#1由 sufang 在二, 08/05/2014 - 11:19 發表。請問Paper上的圖 (Figure 請問Paper上的圖 (Figure 5)，如果不看Figure legend的話，是核還是質? 需要請病理醫師協助嗎? Figure S3 in another paper. 刪除編輯回應


	#2由 natsumi 在三, 08/06/2014 - 13:35 發表。我也初淺判斷一下 Fig 5 FGFR2 病人1:細胞質病人2:細胞質病人3:細胞質與細胞核病人4:細胞質病人5:細胞質與細胞核病人6:細胞質與細胞核。 FGFR3 看起來6位病人細胞質與細胞核都有。 FigS3 以Tumor FGFR2 fusion(-)比較Tumor FGFR2 fusion(+) positive staining在細胞質與細胞核皆有。 ==> 這些PAPER看起，FGFR2 or FGFR3的細胞質在這些病人當中皆有positive staining，當中有些病人是除了細胞質以外，細胞核也有positive staining。細胞質與細胞核都有的染色幾乎是整片深褐色。刪除編輯回應


	#3由 maruko 在二, 08/05/2014 - 15:03 發表。我貼的DDR1 IHC就是由朱醫生判定的喔若我來看覺得 1.Fig5 (同樣都是patient4) FGFR2: 在細胞質 FGFR3: 在核跟質 2.FigS3 FGFR2: 在細胞核跟質 3.我貼的DDR1染色是朱醫師判定的

#10由 maruko 在三, 08/06/2014 - 13:56 發表。

1. 原則上anti-FGFR3 (Santa Cruz, clone:B9) 不論在PH=6或PH=9 retrival條件下對於C9及TW2.6都是有區分性的

(C9: +, TW2.6: -)

2. 但由於PH=6下主要染到細胞核(雖然有一些些染到細胞質) 覺得有點奇怪 (因為分核質的實驗應該有點參考性)，而且只要呈30 sec顏色就出來了，所以覺得這條件下應該非特異性結合高，誤判比例可能會增高

3. 在PH=9下主要染到細胞質也有細胞核，而且用肉眼看比例也不少

4. 再根據以往利用anti-FGFR3 (Santa Cruz, clone:B9) 所發表的paper大多都是在微鹼(PH=8-9)下進行，所以我們認為微鹼下進行retrial的條件應該是比較適合的

Our Thoughts (桀靜精微雷風相薄)