製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(1)的代製抗體已收集，經由細胞lysate測試，證實可以辨認EBV Zta，但akata strain的Zta 的mobility(略低)與細菌表現的不同，接下來要釐清抗體是否有純化，且可否應用於IFA或IP。 (也要釐清是否會辨認B95.8 strain的Zta)
(2)(3)(4)在BL21、DH5α及Rosetta-gami2中，經過調整表達條件，目標蛋白質皆不明顯增多。
Mar 1, 2012
Feb 24, 2012
Summary for the discussion
Studying plans:
1. How is DDR1 regulated by miRNA?
-- We will discuss the detail.
2. How many signaling pathways are involved in oral tumorigenesis?
How many signaling pathways are involved in oral premalignant lesions?
-- There are 12 important signaling pathways invovled in tumorigenesis.
3. Is EGCG working on 12 signaling pathways?
Is EGCG or EGCG/curcumin a good chemoprevention agent in premalignant lesions?
Feb 19, 2012
0215Lab meeting-蔡小丸
1. 完成三組tissue microarray的DDR1, collagen type 1及collagen type 4的染色, 初步計分結果, 似乎DDR1的大量表達與collagen type1的大量表達較為相關,而DDR1大量表達也與疾病的grade較相關
2. 比較OSCC cells DDR1 tyrosine phosphorylation的情形, 結果為DOK, C9, OC-3, OEC-M1, TW2.6>HSC-3, SCC-15, T47D>HEK293, 發現DDR1 tyrosine phosphorylation的程度與gilvec對於這些細胞的抑制能力,沒有很好的相關性, 然而發現在OEC-M1, TW2.6, HSC-3, SCC-15這幾組IP DDR1 sample中, 發現約略80-85kDa的DDR1-associated protein有強烈的tyrosine phosphorylation, 但此蛋白為何未知
3.此外 DDR1的活性反映出的下游為何未知 (但排除非p-MAPK及p-AKT)
4.利用Q-PCR分析一系列oral cells的DDR1 isoforms的表達, 結果發現大多細胞只表達1a及1b這兩種isoforms, 而mRNA表達量也與蛋白表達量具相關性
2. 比較OSCC cells DDR1 tyrosine phosphorylation的情形, 結果為DOK, C9, OC-3, OEC-M1, TW2.6>HSC-3, SCC-15, T47D>HEK293, 發現DDR1 tyrosine phosphorylation的程度與gilvec對於這些細胞的抑制能力,沒有很好的相關性, 然而發現在OEC-M1, TW2.6, HSC-3, SCC-15這幾組IP DDR1 sample中, 發現約略80-85kDa的DDR1-associated protein有強烈的tyrosine phosphorylation, 但此蛋白為何未知
3.此外 DDR1的活性反映出的下游為何未知 (但排除非p-MAPK及p-AKT)
4.利用Q-PCR分析一系列oral cells的DDR1 isoforms的表達, 結果發現大多細胞只表達1a及1b這兩種isoforms, 而mRNA表達量也與蛋白表達量具相關性
Feb 14, 2012
2/13/2012 OrCA Meeting
1. 下次開會: 6月
2. CA OrCA PIs + 王副院長、莊JL、陳YR、黃HG (RA:雪君)、江主秘。
3. BioSignature Program: Leader/Chang Gung 核醫科主任閻紫宸, looking for cause-effect marker. The third meeting will be held on March-8; focus on miRNA/epigenetics/DNAs; funding source, Academia Sinica.
4. 王副院長Lab學生報告 (Wei-Chieh Huang)—長庚閻醫師 has 53 OrCA T/N pairs; miR-491-5p is involved in cell migration and invasiveness, targeting GIT1 and RAB1; OC-3 and C9 were used。
5. Dr. 莊JL
Cellular prion is increased by alcohol consumption involved in tumorigenesis of OSCC
PrpSC/PRNP is significantly up-regulated in OSCC
以電腦判讀TMA result
Second primary tumor (what is the definition of second primary? second primary vs. recurrent)
Alcohol induced TGF-b1 elevaltion is modulated by PrpC
6. 雪君:
Small heat shock protein
HSP27, 60, 70, 90, 110 MW 10–30 are called as small HSP
HSPB1=HSP27
She uses HOK, Cai-27, OC3, OEC-M1, Ca9-22 as cell models
HSP27/HSPB1 enhances OSCC apoptosis via repression in response to oxidative stress
H2O2 (50 uM), ANE (10 ug/ml), ANE (30 ug/ml)
PKCdelta and PTP1B function as downstream of HSP27/HSPB1 in response to oxidative stress.
2. CA OrCA PIs + 王副院長、莊JL、陳YR、黃HG (RA:雪君)、江主秘。
3. BioSignature Program: Leader/Chang Gung 核醫科主任閻紫宸, looking for cause-effect marker. The third meeting will be held on March-8; focus on miRNA/epigenetics/DNAs; funding source, Academia Sinica.
4. 王副院長Lab學生報告 (Wei-Chieh Huang)—長庚閻醫師 has 53 OrCA T/N pairs; miR-491-5p is involved in cell migration and invasiveness, targeting GIT1 and RAB1; OC-3 and C9 were used。
5. Dr. 莊JL
Cellular prion is increased by alcohol consumption involved in tumorigenesis of OSCC
PrpSC/PRNP is significantly up-regulated in OSCC
以電腦判讀TMA result
Second primary tumor (what is the definition of second primary? second primary vs. recurrent)
Alcohol induced TGF-b1 elevaltion is modulated by PrpC
6. 雪君:
Small heat shock protein
HSP27, 60, 70, 90, 110 MW 10–30 are called as small HSP
HSPB1=HSP27
She uses HOK, Cai-27, OC3, OEC-M1, Ca9-22 as cell models
HSP27/HSPB1 enhances OSCC apoptosis via repression in response to oxidative stress
H2O2 (50 uM), ANE (10 ug/ml), ANE (30 ug/ml)
PKCdelta and PTP1B function as downstream of HSP27/HSPB1 in response to oxidative stress.
Feb 1, 2012
2012/2/1 Lab Meeting- 小夏
1. 計數TW05TetLuc/ER dox treat 1, 2, 3, 5, 6, 8天的細胞數。
2. 以467確認Rta expression pattern 在TW01TetER及TW05TetER不同。 Rta expression level by WB: #19 ≧#16＞TW05TetER。 將再確認p21, c-Myc, p53......的表現。
3. 準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的genomic DNA來確認DDR1的mutation位點。
4.準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的cDNA來確認DDR1的isoform。
2. 以467確認Rta expression pattern 在TW01TetER及TW05TetER不同。 Rta expression level by WB: #19 ≧#16＞TW05TetER。 將再確認p21, c-Myc, p53......的表現。
3. 準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的genomic DNA來確認DDR1的mutation位點。
4.準備HEK293, DOK, HSC3, SCC15, OECM1的cDNA來確認DDR1的isoform。
Jan 11, 2012
01/11 Lab Meeting-小嬿
進度報告
1. 為避免viral genome的干擾, 將系統換回TW01TetLuc及TW01TetER_16. 比較Dox處理6, 24, 48小時, CTCF binding在H19 ICR及c-Myc P2 promoter位置的量. Q-PCR結果顯示在兩個細胞中24小時CTCF結合在H19 ICR量比6小時多,並且在48小時下降; 在P2 promoter的位置, Luc細胞在三個時間點的結合量相近, ER細胞在24小時結合量上升, 48小時下降. 但, 兩組CTCF結合位置在Luc組細胞都比ER組來得多
-->加做Ctrl-6hr觀察Luc/ER兩組細胞的background差異
2. 整理過去paper報導CTCF在EBV/KSHV genome上的binding sites(CBS)
--> EBV genome上約有20個位點, KSHV約有10個位點, 兩者的胃點有些有相似
--> 先focus在LCR, K-RTA/BZLF1 promoter, 及OriLyt等位置, 準備設計primers
Jan 10, 2012
1/5 Lab Meeting-ingrid
製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體 (全部已clone成功)
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。
目前採取的策略如下
(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control
(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。
(3) 做BL21及DH5α的competent cell
林同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。
(1) pGEXHis_cZ :已送出代製抗體。
(2) pGEXHis_ER_Q320stop and pGEXHis_ER_L550stop
(3) pGEXHis_KR_E600stop and pGEXHis_KR_Q658stop
(4) pGEXHis_BALF3
(2)(3)(4)除pGEXHis_ER_L550stop尚未表現，其餘在BL21表達蛋白質皆不明顯增多，且皆比預測值大約6-8kDa。
目前採取的策略如下
(1) 使用未開封的LB/BHI或跟其他實驗室要一點LB來做control
(2) 表現蛋白質時，Amp濃度提高至200ug/ml，IPTG濃度降至0.1或0.5mM，加IPTG前應養約3-5小時直到OD600=0.6，同時使用DH5α作表現。
(3) 做BL21及DH5α的competent cell
林同學的論文中提及她用的ER1-320中(Dr. Miller提供，疑是B95-8 strain)很多Arg皆已被突變掉，包括Arg83、86、88、89及90，在我們MABA strain，這些位置皆是Arg。另外根據PWW的紀錄，二者的核酸序列有10個不同處，但只有2個amino acid不同。
Dec 23, 2011
2011121 Lab meeting-蔡小丸
日前投稿至Frontiers in Virology的manuscript的初次結果為minor revised
報告三個reviewers的建議, 重點摘要如下:
1. 針對NLS提問, 希望我們討論為何與過去發現不同 (no.1 reviewer)
2. 希望能加做分析KSHV viral particle的產生情形 (n0.1-3 reviewers)
3. 希望我們討論CDK9磷酸化KR的其他可能位點, 還有是否有其他CDKs結合 (n0.1-3)
4. 覺得luciferase assay差異不明顯 (n0.1, 2)
5. 關於KR吸引CDK9後影響Poll2下游的轉錄機制的可能假說, 覺得證據非常不足 (no.2)
6. 提到KR會被IgG所直接binding (no.2)
7. 要我們再詳加解釋S634A/S636A與KR 10kDa的差距是否來自於磷酸化改變 (no.2)
報告三個reviewers的建議, 重點摘要如下:
1. 針對NLS提問, 希望我們討論為何與過去發現不同 (no.1 reviewer)
2. 希望能加做分析KSHV viral particle的產生情形 (n0.1-3 reviewers)
3. 希望我們討論CDK9磷酸化KR的其他可能位點, 還有是否有其他CDKs結合 (n0.1-3)
4. 覺得luciferase assay差異不明顯 (n0.1, 2)
5. 關於KR吸引CDK9後影響Poll2下游的轉錄機制的可能假說, 覺得證據非常不足 (no.2)
6. 提到KR會被IgG所直接binding (no.2)
7. 要我們再詳加解釋S634A/S636A與KR 10kDa的差距是否來自於磷酸化改變 (no.2)
Dec 7, 2011
12/7 Lab Meeting- 小夏
1. 計數TW05TetER dox treat 1, 2, 3, 4天的細胞數(mix well, to count 3 times)及WST-1 activity沒有差異。建議一樣的條件只做LD與ED組別計數3天後的細胞數及測量WST-1 activity。
2. TW05TetER "escapee" 的實驗，設計失敗。
3. Flag抗體建議以Cell Signalling抗體來降低背景值，Rta的訊號(或雜band)用467抗體來證實。
4.在TW05TetER，dox移除後，ER會隨著時間degrate，其程度與Luc相同，24小時已degrate超過一半; 若dox一直存在下，在96小時前ER的表現也都還會在。至於ER隨著時間增加而增加減少或者是持平，將會繼續釐清，將ER的Kinetics確定清楚。
5. TW05EREV的9株clones以Q-PCR來看viral partical的產生，#1, #4. #7有少量particle，#2, 3, 5, 6, 8, 9則沒有偵測到particle的產生。以WB來看#1, #4. #7 lytic protein的表現Zta: 7>1>4, gp350/220: 1, 7 >4; 隨著dox的induction, #1, #4, #7 的cellular protein p63皆下降，p53皆上升。
2. TW05TetER "escapee" 的實驗，設計失敗。
3. Flag抗體建議以Cell Signalling抗體來降低背景值，Rta的訊號(或雜band)用467抗體來證實。
4.在TW05TetER，dox移除後，ER會隨著時間degrate，其程度與Luc相同，24小時已degrate超過一半; 若dox一直存在下，在96小時前ER的表現也都還會在。至於ER隨著時間增加而增加減少或者是持平，將會繼續釐清，將ER的Kinetics確定清楚。
5. TW05EREV的9株clones以Q-PCR來看viral partical的產生，#1, #4. #7有少量particle，#2, 3, 5, 6, 8, 9則沒有偵測到particle的產生。以WB來看#1, #4. #7 lytic protein的表現Zta: 7>1>4, gp350/220: 1, 7 >4; 隨著dox的induction, #1, #4, #7 的cellular protein p63皆下降，p53皆上升。
Nov 24, 2011
11/23 Lab Meeting-小嬿
進度報告:
1. 確定ChIP的前置步驟條件:
Cell: 4 x 10^7 cells/ml lysis buffer
Sonication: 45" ON, 45" OFF for 10-12 cycles (depend on cell type)
2. 在TW01-EREV_2716細胞中, 觀察到CTCF在Dox處理24小時後結合在cellular promoters上的量比6hrs與未處理Dox的細胞來得多. 顯示 Rta的出現可能讓CTCF對這些promoter的affinity更好. 但是在EREV8細胞中, 同樣的時間點沒辦法看到類似的情況.
--> 補齊其他cellular promoter的PCR detection.
--> 目前推測TW01EREV-2716走lytic cycle的速度比EREV8來得快, 可能24hr還看不到CTCF在EREV8細胞的變化. 試試在EREV8細胞中觀察48小時的CTCF ChIP.
1. 確定ChIP的前置步驟條件:
Cell: 4 x 10^7 cells/ml lysis buffer
Sonication: 45" ON, 45" OFF for 10-12 cycles (depend on cell type)
2. 在TW01-EREV_2716細胞中, 觀察到CTCF在Dox處理24小時後結合在cellular promoters上的量比6hrs與未處理Dox的細胞來得多. 顯示 Rta的出現可能讓CTCF對這些promoter的affinity更好. 但是在EREV8細胞中, 同樣的時間點沒辦法看到類似的情況.
--> 補齊其他cellular promoter的PCR detection.
--> 目前推測TW01EREV-2716走lytic cycle的速度比EREV8來得快, 可能24hr還看不到CTCF在EREV8細胞的變化. 試試在EREV8細胞中觀察48小時的CTCF ChIP.
Nov 22, 2011
11/09 Lab Meeting-ingrid
1. 在ERKV細胞中，將shLUC、shOGT及shMGEA5 lentivirus分別送入，再經由Dox treatment使KSHV進入lytic reactivation，收集medium並用Q-PCR測量產生的KSHV copy number，結果依序為shLUC＜shOGT＜shMGEA5。
2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
2. 製備以下表現質體以供濁水溪公司代製兔子多株抗體
(1) pGExHis_KR_Q658stop and pGExHis_cZ :KRQ658表現蛋白量很少，以至於無法正確判斷是哪一條band，故重新表現蛋白質並以His Ab確認，同時確認質體是否錯誤(原template: GEx-2T-GST_KRQ658)；Zta蛋白質表現量極佳，已送出代製抗體。PS理論上，Zta為270aa約為30kDa，但在SDS-PAGE gel上的band為38kDa，多出8kDa?
(2) pGExHis_ER_Q320stop and pGExHis_ER_L550stop
(3) pGExHis_KR_E600stop and pGExHis_BALF3
Nov 2, 2011
2011026 Lab meeting-蔡小丸
1. 測試anti-DDR1 (Sanat Cruz, C-20) IP條件, 發現增加Ab的量, 並沒有增加IP下來DDR1的量
2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件
3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑
2. 測試serum free後加入collagens對於DDR1活性的影響, 在T47D這組有看到DDR1的Tyr-phosphorylation增加, 但OEC-M1的結果不同, 推測是細胞太滿之後serum free造成的影響, 因此 必須重新試條件
3. 分析silence DDR1後對於下游訊息傳導的影響, 在OEC-M1及TW2.6走向不同路徑
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