Dear all:
...20140304 Journal club 輪到我向各位報告。
題目: Hepatocellular Carcinoma-Associated Mesenchymal Stem Cells Promote Hepatocarcinoma Progression: Role of the S100A4-mIR155-SOCS1-MMP9 Axis
Paper 於附檔請查收~~~謝謝大家!!
Feb 25, 2014
Feb 24, 2014
QPCR validation of gene fusion on clinical samples
由 sufang 在 二, 04/08/2014 - 09:42 發表 Cholangiocarcinoma Dan Robinson MCTP RNA-seq UMich Yi-Mi
For QPCR validations we use real-time PCR with SYBR green on an ABI instrument such as a StepOne, we set the run for 40 cycles, cDNA from 200 ng or so of toral RNA. Using GAPDH control primers we get a Ct of 18 cycles or so.
For a real fusion, the Ct can be anywhere from 24 to 33 but not much above that. We use ABI Fast SYBR Green mastermix kits with UNG for our PCRs. One trouble with the PCR approach is the number of 3’ partners and the number of possible fusion junctions for each 3’ partner. (The FGFR fusion exon is nearly always the same.)
For QPCR validations we use real-time PCR with SYBR green on an ABI instrument such as a StepOne, we set the run for 40 cycles, cDNA from 200 ng or so of toral RNA. Using GAPDH control primers we get a Ct of 18 cycles or so.
For a real fusion, the Ct can be anywhere from 24 to 33 but not much above that. We use ABI Fast SYBR Green mastermix kits with UNG for our PCRs. One trouble with the PCR approach is the number of 3’ partners and the number of possible fusion junctions for each 3’ partner. (The FGFR fusion exon is nearly always the same.)
For QPCR validations we use real-time PCR with SYBR green on an ABI instrument such as a StepOne, we set the run for 40 cycles, cDNA from 200 ng or so of toral RNA. Using GAPDH control primers we get a Ct of 18 cycles or so.
For a real fusion, the Ct can be anywhere from 24 to 33 but not much above that. We use ABI Fast SYBR Green mastermix kits with UNG for our PCRs. One trouble with the PCR approach is the number of 3’ partners and the number of possible fusion junctions for each 3’ partner. (The FGFR fusion exon is nearly always the same.)
Feb 18, 2014
2014-02-18 Journal Club Paper
Title:Claudin-2 Promotes Breast Cancer Liver Metastasis by Facilitating Tumor Cell Interactions with Hepatocytes by En-Wei
(原文下載)
(原文下載)
Feb 13, 2014
20140212 Lab meeting - ingrid
LabMeeting-Ingrid
由 EVKVLIN 在 三, 02/12/2014 - 00:00 發表 LIN Lab 2016 Ingrid LabMeeting YCK
Jan 22, 2014
TCGA DATA 下載
TCGA data download
上次回去尾牙
Dr. Lin 提到TCGA的DATA DOWNLOAD
目前找到的地方是這裡
https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm
我有試著下載 HNSC的miRNAseq的data跟clinical data
看data matrix
其中miRseq的data 應該是已經處理過的 給的數值是count 跟 frequency
但是會有不同read frame的問題
我想 gene expression 應該也會有類似問題
目前還是不知道怎麼處理
跟NGS資料分析 一點都不熟阿! XDDDDD
上次回去尾牙
Dr. Lin 提到TCGA的DATA DOWNLOAD
目前找到的地方是這裡
https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm
我有試著下載 HNSC的miRNAseq的data跟clinical data
看data matrix
其中miRseq的data 應該是已經處理過的 給的數值是count 跟 frequency
但是會有不同read frame的問題
我想 gene expression 應該也會有類似問題
目前還是不知道怎麼處理
跟NGS資料分析 一點都不熟阿! XDDDDD
Jan 20, 2014
20140115 Lab meeting-小丸子
1. 整理與Harvard Skin Disease Research Center Dr.Rheinwald購買之細胞株培養方法
2. 試著釐清Src與DDR1的活性之關聯性: 過去研究指出(1)Src innibitor會抑制collagen I induced DDR1的活性(2)Src會與p-DDR1有交互作用 我的結果指出(1)imatinib處理會抑制Src的活性 (2)比較不同株細胞Src的活性與DDR1的活性似乎有相關 (3)加入Src innibitor會影響OEC-M1中DDR1與Src的交互作用(此現象在TW2.6不明顯) (4)加入Src innibitor 對於OSCC細胞生長的抑制影響不是很明顯(1uM濃度, 48小時)
3. 整理過去發現Collagens處理後DDR1,ITG..等mRNA level增加的例子, 結論為大多條件均在serum free下進行, 因此會嘗試改變為這樣條件去觀察在keratinocytes中處理Collagens對DDR1及ITGs mRNA level的影響 4. QPCR的CT值差異約要載1.5-2以上 以終產物跑agarose gel 才看的出來差異
Jan 16, 2014
20140121 Journal Club paper
Dear all:
隨信附上下週(1/21)journal分享的paper，
題目為 Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis
請查收
The Grainyhead transcription factor Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis in skin: modulation of the miR-21 target MSH2 by RNA-binding protein DND.
隨信附上下週(1/21)journal分享的paper，
題目為 Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis
請查收
The Grainyhead transcription factor Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis in skin: modulation of the miR-21 target MSH2 by RNA-binding protein DND.
Dec 31, 2013
20140107 Journal Club paper
Dear all:
這個是下週我想分享的PAPER，題目為 The EBV oncogene LMP1 protects lymphoma cells from cell death through the collagen-mediated activation of DDR1。
Supplemental materials在此。
最後祝大家新年快樂唷^^
這個是下週我想分享的PAPER，題目為 The EBV oncogene LMP1 protects lymphoma cells from cell death through the collagen-mediated activation of DDR1。
Supplemental materials在此。
最後祝大家新年快樂唷^^
Dec 28, 2013
CRISPR/Cas9 Plasmids
https://www.addgene.org/CRISPR/
Addgene最近在賣的一系列有趣的plasmid
(addgene的另外意思就是 不貴)
目的是辨識特定DNA序列，去切斷、造成Nick、抑制基因表現或是促進基因表現。
最早能辨識DNA序列的 是Zinc finger，後來出現TALEN，這兩個都是protein為主的數位編碼。
後來又有人發現CRISPR/Cas系統
CRISPR/Cas9本來是用在抵禦外來DNA，辨識序列、切斷。
整個原理
簡單的說 Cas9會利用guide RNA (特定序列+一個二級結構的RNA)去辨識DNA序列
再將雙股DNA切斷 (去防禦外來DNA入侵)
一開始被利用其實是拿來做transgene ES，增加DNA recombination 的效率。
這幾年陸續有人將enzyme activty移除，甚至做成fusion protein，
接上抑制性domain HP1/KABP)或是活化domain (VP64)，去專一性的抑制或表現特定基因。
跟Zinc finger跟TALEN比起來，其辨識主要是gRNA 序列而不是protein的排列順序(編碼)
所以可以利用合成oligo-nucletides insert 到gRNA expression plasmid去達成鑑別力，
整個彈性、速度跟CP值，完全大勝前兩項。
CRISPR抑制 (CRISPRi)也可以媲美RNAi，甚至更好。
我看其中一篇reference，他們做CRISPRi後去做Sequence，
發現專一性極高，也無off-target effect。(paper data都是最漂亮的! 哈)
然後合成DNA primer的價錢，也遠比RNA 便宜很多，所以CP值跟彈性都更高。
activation部分，也可以去操作特定基因﹐的表現。
可以用來證明某些未知的transcript 是來自於同一個還是獨立的。
其實在Zinc finger/TALEN的部分，
也是有人將epigentic enzyme，DNMT, PRC Complex or Tet去做fusion，
去達成特地區域的epigentic change。
CRISPR應該也可以做到。
以上資訊分享給大家囉。(就當作我journal club的報告吧!!超敷衍!! 哈)
Addgene最近在賣的一系列有趣的plasmid
(addgene的另外意思就是 不貴)
目的是辨識特定DNA序列，去切斷、造成Nick、抑制基因表現或是促進基因表現。
最早能辨識DNA序列的 是Zinc finger，後來出現TALEN，這兩個都是protein為主的數位編碼。
後來又有人發現CRISPR/Cas系統
CRISPR/Cas9本來是用在抵禦外來DNA，辨識序列、切斷。
整個原理
簡單的說 Cas9會利用guide RNA (特定序列+一個二級結構的RNA)去辨識DNA序列
再將雙股DNA切斷 (去防禦外來DNA入侵)
一開始被利用其實是拿來做transgene ES，增加DNA recombination 的效率。
這幾年陸續有人將enzyme activty移除，甚至做成fusion protein，
接上抑制性domain HP1/KABP)或是活化domain (VP64)，去專一性的抑制或表現特定基因。
跟Zinc finger跟TALEN比起來，其辨識主要是gRNA 序列而不是protein的排列順序(編碼)
所以可以利用合成oligo-nucletides insert 到gRNA expression plasmid去達成鑑別力，
整個彈性、速度跟CP值，完全大勝前兩項。
CRISPR抑制 (CRISPRi)也可以媲美RNAi，甚至更好。
我看其中一篇reference，他們做CRISPRi後去做Sequence，
發現專一性極高，也無off-target effect。(paper data都是最漂亮的! 哈)
然後合成DNA primer的價錢，也遠比RNA 便宜很多，所以CP值跟彈性都更高。
activation部分，也可以去操作特定基因﹐的表現。
可以用來證明某些未知的transcript 是來自於同一個還是獨立的。
其實在Zinc finger/TALEN的部分，
也是有人將epigentic enzyme，DNMT, PRC Complex or Tet去做fusion，
去達成特地區域的epigentic change。
CRISPR應該也可以做到。
以上資訊分享給大家囉。(就當作我journal club的報告吧!!超敷衍!! 哈)
Dec 23, 2013
Dec 11, 2013
2013/12/11 Lab Meeting- 小夏
A. IP結果
1. AE316: 1) KR跟DNMT3b有很強的interaction; 2) ER/gZ跟三個DNMT都有interaction。
2. AE326: KR跟DNMT3b有interaction, ER沒有; ER與KR和DNMT3a都有interaction (雖然ER大於KR, 但KR本身的量也較少, 若補回來可能差不多)。
3. IP將Focus在DNMT3a與Flag-Luc, ER, KR間的Interaction情形。
B. To screen IFNG induced-IDO1 expression
1. 各個OSCC細胞間的IDO1表現應好好的跑在一起公平比較，在AE324中無法下定論。
2. AE324: IFNG can induce IDO1 expression in OSCC cells.
3. AE342: 參考Dr.洪明秀實驗室Wenchy的實驗方法，觀察OSCC在IFNG處理之下的細胞狀況(e.g., Cell rounding, Cell arrest, Cellular senescence, Cell death).
1. AE316: 1) KR跟DNMT3b有很強的interaction; 2) ER/gZ跟三個DNMT都有interaction。
2. AE326: KR跟DNMT3b有interaction, ER沒有; ER與KR和DNMT3a都有interaction (雖然ER大於KR, 但KR本身的量也較少, 若補回來可能差不多)。
3. IP將Focus在DNMT3a與Flag-Luc, ER, KR間的Interaction情形。
B. To screen IFNG induced-IDO1 expression
1. 各個OSCC細胞間的IDO1表現應好好的跑在一起公平比較，在AE324中無法下定論。
2. AE324: IFNG can induce IDO1 expression in OSCC cells.
3. AE342: 參考Dr.洪明秀實驗室Wenchy的實驗方法，觀察OSCC在IFNG處理之下的細胞狀況(e.g., Cell rounding, Cell arrest, Cellular senescence, Cell death).
Dec 5, 2013
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