關於EBV infection

關於EBV infection的實驗, 以下是我的構想, 歡迎大家提供意見討論!

目前預訂

2014/04/03 recover NP460hTert
2014/04/07 seed cells / concentrate virus
2014/04/08 infection
以上

#1由 ingrid 在 五, 04/11/2014 - 10:22 發表。

部分結果出爐

#2由 ingrid 在 一, 04/28/2014 - 16:39 發表。

Rta蛋白質在EBV感染OKB2後有表現出來喔!!

#3由 sufang 在 一, 04/28/2014 - 16:46 發表。

讚!

濁水溪的Zta抗體好嗎? 我們沒有4F10了嗎? 同理，Argene的Rta比濁水溪的Rta好嗎? 張堯老師對我們的homemade Rta抗體真是讚不絕口。

#4由 ingrid 在 一, 05/05/2014 - 14:41 發表。

重新strip後，Zta抗體(4F10)及濁水溪的Rta皆沒有band。

#5由 mmiiee 在 一, 04/28/2014 - 16:41 發表。

AC619_film

附上之前做HEK293 cells的結果與之比較(Akata EBV infected HEK293 cells for 48 hrs):

Rta和Zta的size都比預期小(預期Rta約95 kDa, Zta約36 kDa), 這張blot出現的Rta約85 kDa, Zta約32 kDa和27 kDa

#7由 mmiiee 在 四, 05/15/2014 - 21:13 發表。

抗體&時間點

NP460是不是沒希望啦, 50% positive還是測不到R/Z的話(還是來測測看EBNA1, 會不會全部都走latent去了?) 

在OKB2這組實驗裡感覺Rta要用Argene比LTK更加sensitive, Zta用4F10比LTK好. 

Zta若一樣用75 ug/lane搞不好也可以在24h偵測到. 

另外, 若用IF(免疫螢光染色)的話, 就可以區分GFP(+)到底走latent或lytic了! 

OKB2真是酷斃了!  可惜不是NP細胞 (嘆) 

#8由 EVKVLIN 在 五, 05/16/2014 - 16:04 發表。

LTK的抗體是兔子來的

所以blocking時加入BSA是不是可以減少background?

Cell Signaling或是Santa Cruz的兔子抗體，有沒有類似的建議 ?

#9由 EVKVLIN 在 五, 05/16/2014 - 15:59 發表。

若能區分 latent vs lytic infection...

那就太好了(若能區分 latent vs lytic infection)。

我們現在有幾個點要釐清:

1. NP460hTert的50%感染率要能reproducible

2. hTert, the human terlomerase, 會不會幫助EBV走latency (if so, OKF4-hTert就會和NP460hTert一樣，只能感染卻測不到Z或R, 另外，maruko看到的那個primary NP cell就很值得購買)

3. NP cell vs oral keratinocyte是不是先天就有差。想像 DA Thowerly-Lawson大師提過EBV如何在口腔部細胞長成active lytic replication的plaque。相反的, NPC這邊多是latency狀態居多。

#10由 EVKVLIN 在 四, 04/24/2014 - 16:35 發表。

來試寫一份我們家感染上皮細胞的Protocol怎麼樣?

Ingrid: 是你將功贖罪的大好時機呦!!  你可以署名 「AMO」。

____________________頁2________________

#1由 ingrid 在 三, 04/23/2014 - 09:52 發表。

我做錯了~

在seeding細胞到plate所用的培養液用錯了，本來應該是DF-K/KSFM，但只使用DF-K培養液。我想這樣解釋為什麼這麼多細胞都不貼的原因，另外也解釋丸子說種OKB2細胞隔天會有6分滿而我只有3-4分滿的原因。

還有進行cell senescence實驗時，會不會是因為只養在DF-K培養液裡面10天，而造成細胞生長停滯及SA-beta-Gal assay陽性反應的原因嗎???

---

關於Day9所做的SA-beta-Gal assay

4/17星期四將細胞依照步驟固定後，放置於染色液中，因說明書要求放在37度培養箱w/o二氧化碳，所以放置於養菌培養箱過夜。

4/18星期五就是隔天來發現乾掉了!!!!!!補加新的染色液，放於37度培養箱w/二氧化碳(=細胞培養箱)。

4/20星期天就是隔二天由YLC幫忙將已被染色的細胞保存於glycerol中。 (此時幾乎100%的細胞都有染成藍色=positive)

4/21星期一將細胞拍照存檔。

PS後來發現我的說明書為新版有建議要求放在37度培養箱w/o二氧化碳，但舊版也就是YLC之前用的並無此建議(=之前SA-beta-Gal assay皆是在細胞培養箱完成)，以後應該會借用陳家的細胞培養箱w/o二氧化碳來進行實驗。

#2由 EVKVLIN 在 四, 04/24/2014 - 11:21 發表。

加錯medium的問題

(1): 那Infection時，都還是在有10%FBS的情況下吧？

(2): 可以請natsumi comment一下有沒有CO2真的會影響嗎?

----------------

在這講求省電環保的時代裡，為了一個可能不會影響太多的assay, 特別去開一個incubator實在很不環保啊.  知道為什麼要在沒有CO2的狀態下asasy嗎? thanks.

#3由 ingrid 在 四, 04/24/2014 - 15:06 發表。

回應

那Infection時，還是在有10%FBS的情況下。(DF-K+10%FBS)

#4由 natsumi 在 四, 04/24/2014 - 11:52 發表。

回應

Sigma出的senescence kit上面有說明，如下

Note: The staining of senescent cells is pH dependent. Therefore, the cells cannot be incubated in a CO2 enriched atmosphere during the staining step. 

其實之前在細胞培養箱染也沒有什麼問題，要解決的話，就放在細菌培養箱，周邊用Parafilm封好避免乾掉就好了。

#5由 EVKVLIN 在 四, 04/24/2014 - 16:31 發表。

周邊用Parafilm封好?

那放在原來有CO2的incubator不是也可以杜絕CO2進去? 就這樣子辦吧! 大家意下如何?

#6由 sufang 在 五, 04/11/2014 - 10:29 發表。 真的假的? NP460hTert 沒有TGFb差這麼多嗎? 要不要下週再加做一組有TGFb overnight 的control (NP460hTert就好). 看看能不能重復去年的結果?

#7由 natsumi 在 五, 04/11/2014 - 13:04 發表。 AC550 根據AC550 EBV infect into TW05，有加TGFb還是有差的，尤其是在濃縮病毒情況下。 1xSup -TGFb: 5.4% ==> +TGFb: 7.6% 10xSup -TGFb: 22% ==> +TGFb: 34%

#8由 sufang 在 五, 04/11/2014 - 13:24 發表。 可是、 從來也沒有過只有1.1%這麼差呀! 難道culture medium也很有關係? drop 太多了，令人擔心...

#9由 mmiiee 在 三, 04/09/2014 - 11:14 發表。

目前想看的gene與protein

我想看的gene有: Rta, Zta, MYC, CCND1, JUN, CDK6, CTCF

protein有: Rta, Zta

還有什麼其他想看的嗎?

#10由 EVKVLIN 在 三, 04/09/2014 - 11:30 發表。 What about p21 and SFN、有p63也很不錯! 另外、妳有LANA的PCR primer嗎? 有RCR, LCR那附近的gene primer嗎? thanks.

____________________頁3________________

	#1由 mmiiee 在 三, 04/09/2014 - 13:49 發表。 手上有的... p21, SFN, EBNA1(LCR), BKRF3, BKRF4(RCR), BHLF1, BHRF1(oriLyt)都有primer 剩下p63待設計!

#2由 EVKVLIN 在 三, 04/09/2014 - 15:43 發表。 well... 那就不一定要p63.

#3由 mmiiee 在 四, 04/03/2014 - 10:45 發表。

細胞數

補充60~70% confluence細胞數:

OKB2: 2x10^5/well in 6-well plate

NP460hTert: (請YCK補充, 感恩!)

#4由 ingrid 在 四, 04/03/2014 - 16:34 發表。

細胞數

NP460hTert:  2.1~2.2 x10^5/well in 6-well plate

#5由 EVKVLIN 在 四, 04/03/2014 - 13:12 發表。

看不到下則回應的圖的人..

請使用FireFox或KKMAN瀏覽器。IE據說會出現一堆XX~Sorry.

#6由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 15:51 發表。 來po一下ingrid日前(12/11/2013)給我的整理檔案

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 4

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

#7由 mmiiee 在 三, 04/02/2014 - 14:53 發表。

from Dr. Chang

紀錄一下

1. 重現之前high GFP(+) rate的實驗(穩定/確定條件)(30 % is good!)

2. 觀察GFP何時開始亮? GFP(+)細胞有無/何時分裂? 

3. control做好 (eg, UV-inactivated virus)

#8由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 15:33 發表。

應該來建議..

仲彥他們發展類似LINE的錄音檔案，講完mp3直接上傳上來! 咦，那個YouTube icon是做什麼用著?

#9由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 11:02 發表。 恭喜妳 第一篇文章將得到拿鐵一杯! (大小任挑、時間任選、品牌不拘) 想不想把 TGF-b1 那一步拿掉? 我建議加一個6 h, 去掉72 h, 然後10天改為7天。 刪除   編輯   回應

	#10由 mmiiee 在 三, 04/02/2014 - 10:52 發表。 想試試看回應要怎麼用! 想試試看回應要怎麼用!

#1由 natsumi 在 四, 04/03/2014 - 12:52 發表。

真的只有IE不可以看到圖~

as title換瀏覽器就OK了

and 個人檔案也可以自己編輯文章

#9由 sufang 在 三, 04/02/2014 - 11:02 發表。

恭喜妳

第一篇文章將得到拿鐵一杯! (大小任挑、時間任選、品牌不拘)

---

想不想把 TGF-b1 那一步拿掉? 我建議加一個6 h, 去掉72 h, 然後10天改為7天。

• 刪除
 
• 編輯
 
• 回應

#10由 mmiiee 在 三, 04/02/2014 - 10:52 發表。

想試試看回應要怎麼用!

想試試看回應要怎麼用!

關於CCND1 promoter

關於CCND1 promoter
由 EVKVLIN 在 二, 04/01/2014 - 14:52 發表 EBV and KSHV CTCF Rta senescence
03/25/2014

Dear 嬿如，

昨天張堯老師來電說第一次做出來的DAPA結果竟然與他們預測的不一樣 -> Rta binds to both the wild-type and the RRE mutated probes!所以我與他要了sequence來看看可能的解釋是什麼. (上次K156A的結果，有測CCND1嗎? Rta是直接結合到這個promoter上嗎? thank you)
---------------------
03/26/2014
Dear Dr. Lin,

上次K156A的結果在CCND1上也不是很明顯(EREV8中wild type : K156A= 0.7: 0.76, 而在ERKV中為0.87: 1.21) (如附件Fig.1)

在CCND1 promoter上的potential RRE, 我是用5'-GNCC(N9)GGNG-3'預測出來的
在張堯老師所設計的probe片段中沒有其他位置有GNCC(N8-N10)GGNG或是CC(N9)GG等選擇
但是DAPA結果顯示Rta還是bind此段序列, 所以我猜core element的條件可能要更鬆一點
我試用另一個序列來預測RRE(如附件Fig. 2)
用interval region為8 bp的motif來搜尋probe片段, 則會發現CBS上可能有potential RBS!  (如附件Fig.3的銘黃色方框)

您覺得呢?

#1由 sufang 在 一, 04/21/2014 - 11:41 發表。
DAPA data
DAPA結果如附檔。(如先前討論過的，我們簡化實驗組別，拿掉了 RRE mutant control，以避免讓你們的故事主軸走岔了。)

在 Rta 存在的情形下，CTCF 對 CBS-RRE probe 的 in vitro binding 不會減弱 (甚至有些增強，已重覆兩次實驗)。
暗示在沒有 DNA methylation 的條件下，Rta 並不會抑制 CTCF 對 target site 的結合，這和你們 12~24h 的 ChIP 結果一致。
藉此可以導入你們提到的後期 Rta induces DNA methylation，因而讓 CTCF 離開 DNA。如有需要進一步討論的地方，請再與我聯絡。

#2由 EVKVLIN 在 二, 04/01/2014 - 15:03 發表。
希望不是
希望不是。第一，那你所有的CBS不是重新都要run一下有沒有這樣一種sequence. 第二，那凡是有這樣情形的CBS, Rta應該都會和CTCF競爭bind上去? MYC有嗎?
我Run了一下consite, 發現RREm會比原先RRE多製造出來一個Sp1 site, 雖然分數不是很高。另外，
還會有三個分數頗高的TF會binding上去的site (請見附檔的圖). 有沒有可能在RREm上再動些手腳?

4/2/2014 補上張堯老師給的LMP DAPA probe, 他們的就沒有在mutated probe上多出一個分數中等的Sp1 site, 而且還少掉一些TF binding site (吉).

Functions of S100 Proteins

不好意義!! 那麼晚回覆 S100 Proteins 會和那些receptors作用，我查了一些Paper ，不同的 S100 Proteins 確實會和許多receptors作用，進而影響下游的signaling pathway

有空的話可以參考這篇 (他寫的很詳細) Curr Mol Med. Jan 2013; 13(1): 24–57. 謝謝!!

寄送RNA給高醫黃道揚醫師

由 ingrid 在 二, 04/01/2014 - 13:03 發表 Cholangiocarcinoma FGFR fusion 高醫 黃道揚

Dear SF,

My mailing address is:
高雄市三民區自由一路100號
5F腎功能室.

-----------------------

SFL1=988 ng/ul C9 RNA 15 ug = 15ul (希望他能訂出FGFR3-TACC3)

SFL2=792 ng/ul SW780 RNA 15 ug = 20ul (希望他能訂出FGFR3-BAIAP2L1)

SFL3=1100 ng/ul TW2.6 RNA 15 ug = 13ul(希望他訂不出任何FGFR3 fusion)

#1由 sufang 在 五, 07/25/2014 - 11:29 發表。

7/24 黃醫師來函